1. Генетический мониторинг популяций

Мутагены поражают генетические структуры живых организмов и человека. Повышение уровня мутаций у человека при увеличении загрязнения среды мутагенными факторами признается вредным, и поэтому необходимо проведение комплексной системы мероприятий по генетическому мониторингу популяций в сочетании со скринингом химических соединений на мутагенную активность. Оценка их влияния основана на принципе мониторинга - непрерывного слежения ( Бурдин К.С., 1985 ).

Цель генетического мониторинга - следить за влиянием мутагенов, то есть всех соединений, вводимых в среду, а особенно тех, что играют первостепенную роль для промышленности, сельского хозяйства, медицины, быта.

Есть целый ряд служб по мониторингу за основными процессами, идущими на Земле. Задачей службы генетического мониторинга является регистрация числа мутаций у организмов и сравнения темпа мутирования в последующих поколениях по отношению к исходным. В связи с этой задачей можно выделить целый ряд элементов, знания которых совершенно необходимы для прогноза генетических последствий при загрязнении среды и соответственно для оценки риска при таком загрязнении:

• - следует детально исследовать зависимость выхода различных генетических изменений от дозы мутагенных факторов;

• - необходимо исследовать динамику мутационного процесса в последовательных поколениях популяций организмов, изучить закономерности формирования генетического груза в популяциях разных видов, различающихся по степени панмиксии, плоидности, особенностям популяционных циклов;

• - для прогноза отдаленных генетических последствий воздействия мутагенных факторов на биоценозы необходимы сведения об относительной чувствительности различных видов к мутагенам физической природы и информация о факторах, обуславливающих эту различную чувствительность;

• - используемые тест - системы должны обладать высокой разрешающей способностью и должны максимально отражать суть генетических процессов в природных популяциях;

• - важно исследовать возможные пути адаптации популяции к хроническому воздействию мутагенных факторов;

• - следует проанализировать роль ведущих экологических факторов в формировании мутационного процесса в популяциях различных видов, находящихся под давлением мутагенов (Дубинин Н.П., Шевченко В.А., 1978 ).

На фоне роста мутагенных загрязнений, в связи с ухудшением условий обитания, из кризиса раньше выходят виды, имеющие большую численность и частую смену поколений ( микроорганизмы ). Для популяций человека при возрастающем загрязнении биосферы мутагенами генетическая адаптация невозможна (Акифьев А.П. и др., 1996 ).

В целом, проблема мониторинга за ростом мутаций в популяции - это проблема оценки, изучения и выяснения мутагенных факторов ( Бурдин К.С., 1985 ). Одной из составных частей генетического мониторинга является цитогенетический мониторинг, в задачи которого входит регистрация возникающих под влиянием антропогенных факторов изменений в структуре генофонда и прогнозирование темпов ее перестройки ( Бурдин К.С., 1985; Дмитреева С.А., Парфенов В.И., 1991 ).

Цитогенетические методы контроля за происходящими изменениями окружающей среды позволяют оценить сочетания действий всех неблагоприятных факторов на живые организмы в зависимости от дозы и времени их воздействия. Тем самым они обладают преимуществом перед широко распространенными методами физико - химического контроля, не позволяющими оценить суммарное действие экотоксикантов непосредственно на живой организм ( Горовая А.И. и др., 1996 ).

1.1. Оценка загрязнения окружающей среды с помощью международных тест - систем генетического мониторинга

Обилие химических соединений, которые по мере их появления необходимо проверять на генетическую активность, обусловило разработку простых, надежных и дешевых методов и тест-систем для скрининга, или просеивания, большого числа соединений. Для выявления мутагенов в этих тест-системах используются различные объекты и различные кри ерии. В настоящее время генетическая активность веществ определяется по следующим основным критериям:

1. Генным мутациям - заменам, вставкам и выпадениям пар нуклеотидов;

2. Конверсии;

3. Реципрокной, преимущественно митотической, рекомбинации;

4. Хромосомным аберрациям;

5. Нерасхождения хромосом в митозе;

6. Обменам между сестринскими хроматидами.

Кроме того, применяют такие критерии, как увеличение частоты доминантных леталей у дрозофилы и мышей и частота аномальных сперматозоидов у мышей. Последние два теста нельзя строго отнести к генетическим, однако их результаты хорошо коррелируют с остальными тестами, основанными на критериях повреждения генетического материала. В качестве объектов при массовом скрининге мутагенов используют культуры клеток человека и животных, высшие растения, микроорганизмы, D. melanogaster (С. Г. Инге-Вечтомов, 1998). Биологические тест-системы играют особую роль в оценке состояния окружающей природной среды. Это связано с тем, что результаты химического анализа, проводимого с помощью сложного аналитического оборудования, во многих случаях не позволяют оценить истинную опасность тех или иных загрязнителей на среду обитания, прогнозировать последствия их воздействия на живые организмы ( Евгеньев М.И, 1999 ).

Использование биологических тест - систем позволяет определить изменения в экосистемах на очень ранней стадии, когда они еще не проявляются в виде морфологических и структурных изменений и их нельзя выявить другими методами. Это дает возможность предвидеть нарушения экосистемы и вовремя принять меры. Кроме того, состояние биоиндикаторов можно использовать как дополнительную информацию при оценке здоровья населения ( Оливернусова Л., 1991 ).

Использование набора тест - систем позволит улавливать изменения мутагенности среды как имеющие глобальный характер, так и по отдельным районам, по профессиональным и другим вредностям.

Необходимо иметь экспресс-методы, чтобы на принципе тест-систем быстро и надежно оценивать мутагенность среды и при этом разработать на этой основе возможность общей оценки риска для человека.

Разработка таких тест-систем, имеющих универсальный характер, обладающих высокой пропускной способностью, является актуальной задачей настоящего времени. Этому вопросу посвящают много времени исследователи многих стран ( Дубинин Н.П., Пашин Ю.В., 1978 ).

Требования, предъявляемые тест-системам:

1. Выявить все типы генетических повреждений, то есть геномные, хромосомные и генные (точковые) мутации.

2. Быть настолько чувствительной, чтобы обнаруживать эффекты даже малых доз мутагенов.

3. Быть достаточно дешевой, экспрессивной и давать устойчивые, воспроизводимые результаты.

4. Обнаруживать такие соединения, которые, будучи безвредными, сами по себе при попадании в организм человека способны становиться мутагенами за счет внутриклеточной метаболической активации.

5. Позволять экстраполировать получаемые результаты на человека, в смысле качественной оценки генетического риска.

Идеальной тест-системы не существует. Используют комбинации тест-систем, с помощью которых можно надежно установить мутагенные эффекты многих химических соединений и сделать важные практические выводы и рекомендации (Алтухов Ю.П., 1984; Кавеленова Л.М., 1995; Москвитина Н.С. и др., 1995).

Тесты с использованием микроорганизмов отличаются большой пропускной способностью и чувствительностью к мутагенным воздействиям. Они позволяют в полной мере использовать преимущества селективных методов. Благодаря использованию детально разработанных мутационных систем у микроорганизмов открываются большие возможности не только для тестирования мутагенной активности различных соединений, но и для выяснения механизма их действия. При этом используют мутантов с генетическими изменениями определенной молекулярной природы. Однако главная проблема при применении этих тестов - возможность экстраполяции получаемых результатов на человека.

Наряду с прокариотическими микроорганизмами (бактерии) в тест-системах часто используют эукариотические микроорганизмы - грибы: дрожжи Sacch.cerevisiae, Schiz. pombe, нейроспору и аспергилл, в меньшей степени - водоросли и простейших. У дрожжей, так же как и у бактерий, учитывают прямые и обратные генные мутации, применяют метаболическую активацию, а кроме того дрожжи сами активируют многие промутагены. В дополнение к этому у дрожжей исследуют внутригенную рекомбинацию (конверсию) и реципрокную рекомбинацию в митозе.

Большой практический интерес представляют мутагенные эффекты у многоклеточных животных и в клетках человека. В качестве многоклеточного животного используют дрозофилу, у которой учитывают доминантные летали, нерасхождения и потери хромосом в мейозе, митотический кроссинговер и возникновение мутаций в соматических клетках.

Проверка большого количества соединений на мутагенную активность с использованием млекопитающих, например мышей, не возможна по причине громоздкости и высокой стоимости экспериментов (С. Г. Инге-Вечтомов, 1998).

В настоящее время во всех методических пособиях, в том числе и в международном Руководстве по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических веществ (1989), при цитогенетическом тестировании вредных агентов химической и физической природы по хромосомным аномалиям (ХА) in vivo принято использовать клетки костного мозга животных (мышей, крыс, китайских хомячков), которое предусматривает умерщвление животных для взятия материала. В то же время тестирование мутагенной активности указанных агентов по ХА in vitro обычно проводится на метафазных пластинках из лимфоцитов крови человека. Анализ на лимфоцитах крови является технически более простым и более удобным, чем на клетках костного мозга, и по информативности более надежным (Цит. по ст. Монахова А.С, 2000).

Монахов А.С. предлагает использовать при исследовании мутагенной активности всех вредных агентов LМикрометод культивирования лимфоцитов в периферической крови крыс для исследования хромосом (Монахов А.С., 2000). Этот метод позволяет проводить исследования как мутагенного, так и канцерогенного эффекта воздействующего вредного фактора in vivo на индивидуальных особях в динамике до их естественной смерти без нанесения им заметного вреда. Данный метод позволяет получать большое количество высококачественных метафазных пластинок, пригодных для любого окрашивания хромосом: рутинного, G- окрашивания, FISH и СХО. Этим методом проведено тестирование на мутагенную и канцерогенную активность ряда радионуклеидов и нитрозометилмочевины (Монахов А.С., 2000).

К числу быстрых тестов с использованием высших растений относится учет хромосомных аберраций в корнях традесканции, Crepis, Vicia и др. (С. Г. Инге-Вечтомов, 1998).

В настоящее время встает проблема разработки не только чувствительных тест-систем, которых появляется все больше, но и системы тестов. Многими исследователями предложены различные варианты ступенчатых систем тестирования мутагенов и промутагенов, основу которых составляет скрининг, или просеивание большого числа веществ на системах, позволяющих быстро оценить их генетическую активность.

Большое значение для оценки последствий загрязнения окружающей среды генетически активными факторами имеет наблюдение за природными популяциями растений, животных и микроорганизмов. Такой постоянный контроль (мониторинг) изменений генетической структуры природных популяций позволяет улавливать изменения и прогнозировать их дальнейшие последствия (С. Г. Инге-Вечтомов, 1998).