Гистология

до мы {гибрид-клетка с геномом от двух разных клеток; ома — окончание в названиях опухолей). Такие гибридомы способны размножаться длительно в культуре и синтезировать антитела определенного вида. Каждый клон гибридомы является источником моноклональных антител. Все молекулы антител данного вида обладают одинаковой специфичностью связывания антигенов. Можно получать моноклональные антитела против любого белка, содержащегося в клетке, и использовать их для установления локализации белков в клетке, а также для выделения белка из смеси (очистка белков), что позволяет исследовать структуру и функцию белков. Моноклональные антитела применяют также в технологии клонирования генов.

Антитела можно использовать для изучения функции различных молекул, вводя их через плазмолемму непосредственно в цитоплазму клеток тонкой стеклянной пипеткой. Например, введение антител к миозину в цитоплазму оплодотворенной яйцеклетки морского ежа останавливает разделение цитоплазмы.

Технология рекомбинантных ДНК. Классические генетические методы позволяют изучать функцию генов, анализируя фенотипы мутантных организмов и их потомства. Технология рекомбинантных ДНК дополняет эти методы, позволяет проводить детальный химический анализ генетического материала и получать в больших количествах клеточные белки.

Методы гибридизации широко используют в современной биологии для изучения структуры генов и их экспрессий.

Методы исследования химического состава и метаболизма клеток и тканей

Для изучения химического состава биологических структур — локализации веществ, их концентрации и динамики в процессах метаболизма применяют специальные методы исследования.

Цито- и гистохимические методы. Эти методы позволяют выявлять локализацию различных химических веществ в структурах клеток, тканей и органов — ДНК, РНК, белков, углеводов, липидов, аминокислот, минеральных веществ, витаминов, активность ферментов. Эти методы основаны на специфичности реакции между химическим реактивом и субстратом, входящим в состав клеточных и тканевых структур, и окрашивании продуктов химических реакций. Для повышения специфичности реакции часто применяют ферментативный контроль. Например, для выявления в клетках рибонуклеиновой кислоты (РНК) часто используют галлоцианин — краситель с основными свойствами, а наличие РНК подтверждают контрольной обработкой рибонуклеазой, расщепляющей РНК. Галлоцианин окрашивает РНК в сине-фиолетовый цвет. Если срез предварительно обработать рибонуклеазой, а затем окрасить галлоцианином, то отсутствие окрашивания подтверждает наличие в структуре рибонуклеиновой кислоты. Описание многочисленных цито- и гистохимических методов дается в специальных руководствах.

В последние годы сочетание гистохимических методов с методом электронной микроскопии привело к развитию нового перспективного направления — э л е к т р о н н о й гистохимии . Этот метод позволяет изучать локализацию различных химических веществ не только на клеточном, но и на субклеточном и молекулярном уровнях.

21

Для изучения макромолекул клеток используют очень чувствительные методы с применением радиоактивных изотопов и антител, позволяющие обнаружить даже небольшое содержание молекул (менее 1000).

Радиоактивные изотопы при распаде ядра испускают заряженные частицы (электроны) или излучение (например, гамма-лучи), которые можно зарегистрировать в специальных приборах. Радиоактивные изотопы используют в методе радиоавтографии. Например, с помощью радиоизотопов 3Н- тимидина исследуют ДНК ядра, с помощью 3Н-уридина — РНК.

Метод радиоавтографии. Этот метод дает возможность наиболее полно изучить обмен веществ в разных структурах. В основе метода лежит использование радиоактивных элементов (например, фосфора — 32Р, углерода — 14С, серы — 35S, водорода — 3Н) или меченных ими соединений. Радиоактивные вещества в гистологических срезах обнаруживают с помощью фотоэмульсии, которую наносят на препарат и затем проявляют. В участках препарата, где фотоэмульсия соприкасается с радиоактивным веществом, происходит фотореакция, в результате которой образуются засвеченные участки (треки). Этим методом можно определять, например, скорость включения меченых аминокислот в белки, образование нуклеиновых кислот, обмен йода в клетках щитовидной железы и др.

Методы иммунофлюоресцентного анализа. Применение антител. Антите - ла — защитные белки, вырабатываемые плазмоцитами (производными В-лимфоцитов) в ответ на действие чужеродных веществ (антигенов). Количество различных форм антител достигает миллиона. Каждое антитело имеет участки для «узнавания» молекул, вызвавших синтез этого антитела. В связи с высокой специфичностью антител в отношении антигенов они могут быть использованы для выявления любых белков клетки. Для выявления локализации белков антитела окрашивают флюоресцирующими красителями, а затем клетки изучают с помощью флюоресцентной микроскопии. Антитела можно использовать также для изучения антигенов на ультраструктурном уровне с помощью электронного микроскопа. Для этого антитела метят электронно-плотными частицами (микросферы коллоидного золота). Для усиления специфичности реакции применяют моноклональные антитела, образуемые линией клеток, — клонами, полученной методом гибридом из одной клетки. Метод гибридом позволяет получать моноклональные антитела с одинаковой специфичностью и в неограниченных количествах.

Методы иммунофлюоресцентного анализа широко и эффективно используются в современной гистологии. Эти методы применяются для изучения процессов дифференцировки клеток, выявления в них специфических химических соединений и структур. Они основаны на реакциях антиген — антитело. Каждая клетка организма имеет специфический антигенный состав, который главным образом определяется белками. Продукты реакции можно окрашивать и выявлять в люминесцентном микроскопе, например выявление актина и тубулина в клетке с помощью метода иммунофлюоресцентного анализа (см. главу IV).

Современные методы исследований позволяют проводить анализ химического состава различных структурных компонентов клеток, как фиксированных, так и живых. Изучение отдельных внутриклеточных структур стало возможным после разработки технологий фракционирования клеточного содержимого.

22

Фракционирование клеточного содержимого

Фракционировать структуры и макромолекулы клеток можно различными методами — ультрацентрифугированием, хроматографией, электрофорезом. Подробнее эти методы описаны в учебниках биохимии.

Ультра центр и ф у г и р о в а н и е. С помощью этого метода клетки можно разделить на органеллы и макромолекулы. Вначале разрушают клетки осмотическим шоком, ультразвуком или механическим воздействием. При этом мембраны (плазмолемма, эндоплазматический ретикулум) распадаются на фрагменты, из которых формируются мельчайшие пузырьки, а ядра и органеллы (митохондрии, аппарат Гольджи, лизосомы и пероксисомы) сохраняются интактными и находятся в образующей суспензии.

Для разделения вышеуказанных компонентов клетки применяют высокоскоростную центрифугу (80 000—150 000 оборотов/мин). Вначале оседают (седиментируют) на дне пробирки более крупные части (ядра, цитоскелет). При дальнейшем увеличении скоростей центрифугирования надосадочных фракций последовательно оседают более мелкие частицы — сначала митохондрии, лизосомы и пероксисомы, затем микросомы и мельчайшие пузырьки и, наконец, рибосомы и крупные макромолекулы. При центрифугировании различные фракции оседают с различной скоростью, образуя в пробирке отдельные полосы, которые можно выделить и исследовать. Фракционированные клеточные экстракты (бесклеточные системы) широко используют для изучения внутриклеточных процессов, например для изучения биосинтеза белка, расшифровки генетического кода и др.

Х р о м а т о г р а ф и я широко используется для фракционирования бел-

ков.

Э л е к т р о ф о р е з позволяет разделить белковые молекулы с различным зарядом при помещении их водных растворов (или в твердом пористом матриксе) в электрическом поле.

Методы хроматографии и электрофореза применяют для анализа пептидов, получаемых при расщеплении белковой молекулы, и получения так называемых пептидных карт белков. Подробно эти методы описаны в учебниках биохимии.

Изучение химического состава живых клеток. Для изучения распределения веществ и их метаболизма в живых клетках используют методы ядерного магнитного резонанса и микроэлектродную технику.

Я д е р н ы й м а г н и т н ы й р е з о н а н с (ЯМР) позволяет изучать малые молекулы низкомолекулярных веществ. Образец ткани содержит атомы в различных молекулах и в различном окружении, поэтому он будет поглощать энергию на различных резонансных частотах. Диаграмма поглощения на резонансных частотах для данного образца составит его спектр ЯМР. В биологии сигнал ЯМР от протонов (ядер водорода) широко используется для изучения белков, нуклеиновых кислот и др. Для изучения макромолекул внутри живой клетки часто применяют изотопы 3Н, 13С, 35К, 31Р для получения сигнала ЯМР и слежения за его изменением в процессе жизнедеятельности клетки. Так, 31Р используется для изучения мышечного сокращения

— изменений содержания в тканях АТФ и неорганического фосфата. Изотоп 13С позволяет с помощью ЯМР исследовать многие процессы, в которых участвует глюкоза. Использование ЯМР ограничено его низкой чувствительностью: в 1 г живой ткани должно содержаться не менее 0,2 мМ исследуемого вещества. Преимуществом метода является его безвредность для живых клеток.

23

М и к р о э л е к т р о д н а я т е х н и к а . Микроэлектроды представляют собой стеклянные трубочки, заполненные электропроводным раствором (обычно раствор КС1 в воде), диаметр конца которых измеряется долями микрона. Кончик такой трубочки можно вводить в цитоплазму клетки через плазмолемму и определять концентрацию ионов Н+, Na+, К+, CI", Са2+, Mg2+, разность потенциалов на плазмолемме, а также производить инъекцию молекул в клетку. Для определения концентрации конкретного иона используют ионселективные электроды, которые заполняют ионообменной смолой, проницаемой только для данного иона. В последние годы микроэлектродную технику применяют для изучения транспорта ионов через специальные ионные каналы (специализированные белковые каналы) в плазмолемме. При этом используют микроэлектрод с более толстым кончиком, который плотно прижимают к соответствующему участку плазмолеммы. Этот метод позволяет исследовать функцию одиночной белковой молекулы. Изменение концентрации ионов внутри клетки можно определить с помощью люминесцирующих индикаторов. Например, для изучения внутриклеточной концентрации Са2+ используют люминесцентный белок акварин (выделен из медузы), который излучает свет в присутствии ионов Са2+ и реагирует на изменение концентрации последнего в пределах 0,5— 10 мкМ. Синтезированы также флюоресцентные индикаторы, прочно связывающиеся с Са2+. Создание различных новых типов внутриклеточных индикаторов и современных способов анализа изображений позволяет точно и быстро определять внутриклеточную концентрацию многих низкомолекулярных веществ.

Количественные методы

В настоящее время наряду с качественными методами разработаны и применяются к о л и ч е с т в е н н ы е г и с т о х и м и ч е с к и е методы определения содержания различных веществ в клетках и тканях. Особенность количественно-гистохимических (в отличие от биохимических) методов исследования заключается в возможности изучения концентрации и содержания химических компонентов в конкретных структурах клеток и тканей.

Цитоспектрофотометрия — метод количественного изучения внутриклеточных веществ по их абсорбционным спектрам.

Цитоспектрофлюориметрия — метод количественного изучения внутриклеточных веществ по спектрам их флюоресценции или по интенсивности флюоресценции на одной заранее выбранной волне (цитофлюориметрия).

Современные микроскопы — цитофлюориметры позволяют обнаружить

вразличных структурах малые количества вещества (до 1014—10~16 г) и оценить локализацию исследуемых веществ в микроструктурах.

Интерферометрия. Этот метод позволяет оценить сухую массу и концентрацию плотных веществ в живой и фиксированной клетках. С помощью этого метода, например, можно установить суммарное содержание белков

вживых и фиксированных клетках.

Методы анализа изображения клеточных и тканевых структур

Полученные изображения микрообъектов в микроскопе, на телевизионном экране дисплея, на электронных микрофотографиях могут подвергаться специальному анализу — выявлению морфометрических, денситометрических параметров и их статистической обработке.

24

Морфометрические методы позволяют определять с помощью специальных сеток (Е. Вейбеля, А. А. Глаголева, С. Б. Стефанова) число любых структур, их площади, диаметры и др. В частности, в клетках могут быть измерены площади ядер, цитоплазмы, их диаметры, ядерно-цитоплазмати- ческие отношения и др. Существуют ручная м о р ф о м е т р и я и авто- м а т и з и р о в а н н а я морфометрия, при которой все параметры измеряются и регистрируются в приборе автоматически.

В последние годы все большее распространение получают автоматизированные системы обработки изображений (АСОИз), позволяющие наиболее эффективно реализовать перечисленные выше количественные методы для изучения клеток и тканей. При этом аналитические возможности количественной микроскопии дополняются методами анализа и распознавания образцов, основанными на обработке с помощью электронных вычислительных машин (ЭВМ) информации, извлекаемой из изображений клеток и тканей. По существу можно говорить об устройствах, не только усиливающих оптические возможности зрительного анализатора человека, но и многократно расширяющих его аналитические возможности. Высказывается мнение, что АСОИз совершает такой же переворот в морфологии, какой около 300 лет назад произошел благодаря изобретению светового, а около 50 лет назад — электронного микроскопа, поскольку они не только неизмеримо повышают производительность труда исследователя и не только объективизируют наблюдения, но и позволяют получать новую информацию о невыявляемых ранее процессах, численно моделировать и прогнозировать их развитие в клетках и тканях.

Вместе с тем участие в эксперименте ЭВМ требует от исследователя нового подхода к его проведению, владения навыками составления алгоритмов процесса исследования, точности рассуждений и в конечном итоге повышения научно-методического уровня исследования.

Одним из методов, существенно расширивших число решаемых морфологических задач, является оптико-структурный машинный анализ (ОСМА),

предложенный в 1965 г. К.М.Богдановым. В 1978 г. автор метода был удостоен Государственной премии СССР. С появлением ОСМА сделан качественно новый шаг в разработке единой методологии количественного анализа микроструктур на основе статистических характеристик. В последнее время ОСМА нашел эффективное применение в исследовательской практике и народном хозяйстве.

На рис. 2 представлена созданная в нашей стране фирмой «ЛОМО» автоматизированная система обработки изображений «Протва-Mll». Система предназначена для проведения комплексных исследований клеток и тканей

сиспользованием методов абсорбционной, флюоресцентной микроскопии

ирадиоавтографии.

Входящий в состав системы специальный сканирующий оптический или электронный микроскоп осуществляет последовательный просмотр изображения препарата по двум координатам, преобразуя его в цифровую форму, и вводит в ЭВМ, которая в свою очередь производит цифровую обработку изображения и выдает информацию о геометрических и других характеристиках анализируемого объекта.

С помощью цветного дисплея исследователь может «препарировать» изображение, выделяя лишь те структурные составляющие, которые его интересуют. Входящие в состав ЭВМ емкие накопители информации на магнитных дисках или лентах

25

Рис. 3. Автоматизированная обработка изображения клетки (схема).

Изображение лейкоцита (а), его цитоплазмы (б) и ядра (в). I — цифровое изображение; II — гистограммы оптической плотности; III — двухмерные гистограммы зависимости значений оптической плотности.

Полученные таким образом параметры представляют многомерный «портрет» клетки и имеют конкретное числовое выражение. Они могут быть подвергнуты различным методам статистической обработки, позволяют предельно точно классифицировать микрообъекты, выявлять особенности их структуры, необнаруживаемые визуально.

Таким образом, применение новых методов исследований в гистологии, цитологии и эмбриологии позволяет выяснить общие закономерности организации тканей и клеток, структурные основы биохимических процессов, определяющих функцию конкретных структурных компонентов клетки.

Г л а в а III

КРАТКИЙ ОЧЕРК РАЗВИТИЯ ГИСТОЛОГИИ, ЦИТОЛОГИИ И ЭМБРИОЛОГИИ

Становление гистологии, цитологии и эмбриологии как наук

Развитие гистологии. Успехи гистологии как науки о строении и происхождении тканей и их компонентов прежде всего связаны с развитием техники, оптики и методов микроскопирования. Микроскопические исследования позволили накопить данные по тонкому строению организма и на этом основании сделать теоретические обобщения. В истории учения о тканях и микроскопическом строении органов следует различать три периода: 1-й — домикроскопический (продолжительностью около 2000 лет), 2-й — микроскопический (около 300 лет), 3-й — современный, сочетающий достижения в области электронной микроскопии, иммуноцитохимии, цитофотометрии и др. (с середины XX столетия).

Первый период, наиболее продолжительный (с IV в. до н.э. и до середины XVII в.), является собственно предысторией гистологической науки, основанной на макроскопической технике. В этот период фактически создавались лишь общие представления о тканях как об «однородных» частях организма, отличающихся друг от друга физическими свойствами («твердые», «мягкие»), удельным весом («тонущие в воде», «нетонущие») и пр. Но так как представления о тканях в то время складывались лишь на основании анатомического расчленения трупов, то все классификации тканей строились на их внешнем сходстве и различиях. Вследствие этого в одну группу попадали иногда такие различные ткани, как нервная и соединительная (нерв и сухожилие), поэтому в середине XVII в., когда английским физиком Р. Гуком был усовершенствован микроскоп1 (1665), позволивший изучить тонкое строение тканей растений и животных, начинается второй период в учении о тканях. С этого времени усилились разработка технических методов исследования невидимых невооруженным взглядом структурных единиц тканей и накопление фактического материала об их строении. В этот период «зуд познания», по выражению М. Мальпиги, и «желание постичь дела творца» (Н. Грю) побуждали многих исследователей к микроскопическим исследованиям.

Первые микроскописты второй половины XVII в. — физик Р. Гук, анатом М. Мальпиги, ботаник Н. Грю, оптик-любитель А. Левенгук и др. с помощью микроскопа описали строение кожи, селезенки, крови, мышц, семенной жидкости и др. Каждое исследование по существу являлось открытием, которое плохо уживалось с метафизическим взглядом на природу, складывавшимся веками. Случайный характер открытий, несовершенство микроскопов, метафизическое мировоззрение не позволили в течение 100 лет (с середины XVII в. до середины XVIII в.) сделать существенные

1 Создание первой модели микроскопа относится ко второму десятилетию XVII в.

28

шаги вперед в познании закономерностей строения животных и растений, хотя и делались попытки обобщений (теории «волокнистого» и «зернистого» строения организмов и др.).

В конце XVIII — начале XIX в. трудами многих отечественных (петербургских), а также голландских ученых и мастеров были созданы ахроматические микроскопы, которые сделали более достоверными микроскопические наблюдения и позволили перейти к систематическому изучению структурных элементов самых разнообразных животных и растительных организмов.

Применение ахроматического микроскопа в научных исследованиях послужило новым импульсом к развитию гистологии. В начале XIX в. сделано первое изображение ядер растительных клеток. Я. Пуркинье (в 1825— 1827 гг.) описал ядро в яйцеклетке курицы, а затем ядра в клетках различных тканей животных. Позднее им было введено понятие «протоплазма» (цитоплазма) клеток, охарактеризованы форма нервных клеток, строение желез и др. Р. Броун сделал заключение о том, что ядро является обязательной частью растительной клетки. Таким образом, постепенно стал накапливаться материал о микроскопической организации животных и растений и строении «клеток» (cellula), увиденных впервые Р. Гуком.

Завершением этого периода являются исследования А.Дютроше, П. Ф. Горянинова, Г. Валентина (ученика Я. Пуркине), Я. Генле (ученика И. Мюллера), М. Шлейдена и особенно Т. Шванна, который обобщил все предыдущие исследования и сформулировал клеточную теорию (1838— 1839). Т. Шванн рассматривал клетку как универсальный структурный компонент животного и растительного мира. Это поставило на материалистическую основу биологию и патологию.

Создание клеточной теории оказало огромное прогрессивное влияние на развитие биологии и медицины. В середине XIX в. начался период бурного развития о п и с а т е л ь н о й гистологии . На основе клеточной теории были изучены состав различных органов и тканей, их развитие, что позволило уже тогда создать в основных чертах м и к р о с к о п и ч е с к у ю анато - мию и уточнить классификацию тканей с учетом их микроскопического строения (А. Кёлликер и др.). Но научная мысль во второй половине XIX в. не могла плодотворно развиваться без дальнейших успехов гистологической техники и методов микроскопического исследования. В этот период были введены в практику и усовершенствованы водные и масляные иммерсионные объективы, изобретен микротом, применены новые фиксаторы (формалин, осмиевая кислота, хромовая кислота). Весьма плодотворным оказался метод импрегнации солями серебра, разработанный итальянским ученым К. Гольджи, описавшим внутриклеточный сетчатый аппарат (аппарат Гольджи). Этот метод и его модификации позволили провести фундаментальные исследования нервной системы (Р. Кахаль) и создать основы н е й р о г и - стологии. Признанием научных заслуг К. Гольджи и Р. Кахаля явилось присуждение им в 1906 г. Нобелевской премии. В последней четверти XIX в. были открыты и другие органеллы клетки.

Благодаря успехам, достигнутым в области изучения строения клетки, в конце XIX в. были заложены основы цитологии. Но микроскопирование фиксированных клеток не позволяло говорить о процессах жизнедеятельности в них. Поэтому внимание ученых привлекли методы культивирования клеток и тканей (И. П. Скворцов, Р. Гаррисон, А. Каррель и др.).

29

Методы прижизненного введения красителей, примененные многими исследователями в то время, введение инородных тел в организм и другие методы сделали возможным изучение физиологии гистологических структур. В 1900 г. Н. М. Гайдуковым был предложен метод микроскопирования живых объектов в темном поле. В это же время был изобретен микроманипулятор, с помощью которого можно было производить операции на отдельных клетках (удаление ядер, разрезы клеток и др.) в целях выяснения роли и значения их в жизнедеятельности организма.

Развитие эмбриологии. Эмбриология, изучающая закономерности пренатального развития организмов, имеет еще более продолжительную историю своего формирования как науки. Тайна зарождения, развития и становления различных живых существ, возможности создания условий для проявления этих процессов (по крайней мере у птиц) возникали еще в древности. Так, упоминания о выведении цыплят в искусственных условиях (инкубаторы) в Древнем Египте, а затем в Индии, Китае имеются в трудах греческих философов. Задолго до нашей эры появились упоминание о плаценте в связи с рождением ребенка и некоторые другие сведения.

Однако первые медицинские эмбриологические наблюдения и формирование важных эмбриологических представлений, по-видимому, принадлежат Гиппократу (IV в. до н. э.) и его последователям («О природе женщины», «О семимесячном плоде», «О сверхоплодотворении», «О семени», «О природе ребенка» и др.). Многие высказывания врачей того этапа развития медицины, скорее всего, представляли умозрительные заключения, которые тем не менее были близки к истине. Например, утверждение «о высыхании» зародыша по мере его развития, т.е. об уменьшении содержания воды в нем, или о необходимости смешения мужского и женского семени (мужские и женские половые клетки были обнаружены с помощью микроскопа соответственно лишь в XVII и XIX столетиях).

Современник Гиппократа Аристотель в своих сочинениях «О возникновении животных» и др. по существу положил начало общей и сравнительной эмбриологии. Предложенная им классификация животных по эмбриологическим признакам явилась итогом научного анализа рассматриваемых им в 5 книгах вопросов («О происхождении семени», «О формах матки у различных животных», «О живорождении и ящеророждении» и др.). Следует заметить, что уже Аристотелем был поднят вопрос о механике развития и сформировано положение об э п и г е н е з е (от греч. epi — над и genesis — происхождение). Отстаивая идею развития, Аристотель основывался на неверных умозрительных заключениях о том, что зародыш развивается из женской крови («материи») и внесенного мужчиной семени («души»), одухотворившего эту кровь. Подобные идеалистические рассуждения о нематериальном факторе (энтелехии) существовали долго и после Аристотеля в связи с сильным влиянием теологии на мировоззрение ученых, пытавшихся разобраться в причинности развития и конечной цели.

До середины XVII в. история эмбриологии не была ознаменована существенными достижениями, хотя известно, что некоторые конкретные описания зародышей, их временных и постоянных органов были сделаны к этому времени в разных странах.

В эпоху Возрождения определенный вклад в эмбриологию внес В. Гарвей — автор открытия кровообращения, который, проанализировав развитие зародышей, описал их в книге «Зарождение животных» (1651). Он выс-

30