Material_mikra_2015_by_zOrg

11

Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год

1.Биогенные химические элементы (С, О, N, H). На их долю приходится 95% сухого остатка, в т.ч. 50%- C, 20%- O, 15%- N, 10%- H).

2.Макроэлементы- P, S,Cl, K, Mg, Ca, Na. На них приходится около 5 %.

3.Микроэлементы- Fe, Cu, I, Co, Mo и др. На них приходятся доли процента, однако они имеют важное значение в обменных процессах.

Химические элементы входят в состав различных веществ - воды, белков, липидов, нейтральных жиров, углеводов, нуклеиновых кислот. Синтез соединений контролируется генами. Многие вещества бактериальная клетка может получать извне - из окружающей среды или организма хозяина.

Вода составляет от 70 до 90 % биомассы. Содержание воды больше у капсульных бактерий, меньше всего - в спорах.

Белки встречаются во всех структурных элементах клетки. Белки могут быть более простые (протеины) и сложные (протеиды), в чистом виде или в комплексе с липидами, сахарами. Выделяют структурные (структурообразующие) и функциональные (регуляторные) белки, к последним относятся ферменты.

В состав белков входят как обычные для эукариотов аминокислоты, так и оригинальные- диаминопимелиновая, D-аланин, D-глютанин, входящие в состав пептидогликанов и капсул некоторых бактерий. Только в спорах находится дипиколиновая кислота, с которой связана высокая резистентность спор. Жгутики построены из белка флагеллина, обладающего сократительной способностью и выраженными антигенными свойствами. Пили (ворсинки) содержат особый белок- пилин.

Пептидную природы имеют капсулы представителей рода Bacillus, возбудителя чумы, поверхностные антигены ряда бактерий, в том числе стафилококков и стрептококков. Белок А - специфический белок S.aureus - фактор, обусловлавливающий ряд свойств этого возбудителя. Белок М - специфический белок гемолитических стрептококков серогруппы А, позволяющий дифференцировать серовары (около 100), что имеет эпидемиологическое значение.

Ряд белков содержит наружная мембрана грамотрицательных бактерий, из которых 3 - 4 мажорных (основных) и более 10второстепенных, выполняющих различные функции. Среди мажорных белков- порины, образующие диффузные поры, через которые в клетку могут проникать мелкие гидрофильные молекулы.

Белки входят в состав пептидогликана- биополимера, составляющего основу бактериальной клеточной стенки. Он состоит из остова (чередующиеся молекулы двух аминосахаров) и двух наборов пептидных цепочекбоковых и поперечных. Наличие двух типов связейгликозидных (между аминосахарами) и пептидных, которые соединяют субъединицы пептидогликанов, придают этому гетерополимеру структуру молекулярной сети. Пептидогликан-

наиболее устойчивое соединение, которое образует ригидную мешковидную макромолекулу, определяющую постоянную форму бактерий и ряд их свойств.

1.Пептидогликан содержит родо- и видоспецифические антигенные детерминанты. 2.Он запускает классический и альтернативный пути активации системы комплемента. 3.Пептидогликан тормозит фагоцитарную активность и миграцию макрофагов.

4.Он способен инициировать развитие гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). 5.Пептидогликан обладает противоопухолевым действием.

6.Он оказывает пирогенное действие, т.е. вызывает лихорадку.

Из соединений белков с небелковыми компонентами наибольшее значение имеют липопротеиды, гликопротеиды и нуклеопротеиды.

Удивительное таинство жизни - синтез белка осуществляется в рибосомах. Существует два основных типа рибосом - 70S (S- константа седиментации, единица Сведберга) и 80S. Рибосомы первого типа встречаются только у прокариотов. Антибиотики не действуют на синтез белка в рибосомах типа 80S, распространенных у эукариотов.

Липиды (главным образом форфолипиды) содержатся в цитоплазматической мембране (липидный бислой), в также в наружной мембране грамотрицательных бактерий. Есть микроорганизмы, содержащие большое количество липидов (до 40% сухого остатка)- микобактерии. В состав липидов входят различные жирные кислоты, весьма специфичные для разных групп микроорганизмов. Их определение имеет в ряде случаев диагностическое значение, например у анаэробов, микобактерий.

У микобактерий туберкулеза в составе липидов имеется ряд кислотоустойчивых жирных кислот- фтионовая, миколовая и др. Высокое содержание липидов и их состав определяют многие свойства микобактерий туберкулеза:

-устойчивость к кислотам, щелочам и спиртам; -трудная окрашиваемость красителями (используют специальные методы окраски, чащепо ЦилюНильсену);

-устойчивость возбудителя к солнечной радиации и дезосредствам; - патогенность.

Тейхоевые кислоты встречаются в клеточных стенках грамположительных бактерий. Представляют собой водорастворимые линейные полимеры, содержащие остатки глицерина или рибола, связанные фосфодиэфирными связыми. С тейхоевыми кислотами связаны главные поверхностные антигены ряда грамположительных бактерий.

Углеводы встречаются чаще в виде полисахаридов, кторые могут быть экзо- и эндоклеточными. Среди экзоклеточных полисахаридов выделяют каркасные (входят в состав капсул) и истинно экзополисахариды (выходят во внешнюю среду). Среди бактериальных полисахаридов многие находят медицинское применение. Декстраны- полисахариды с большой молекулярной массой, по виду напоминают слизь. 6% растворкровезаменитель полиглюкин. Декстрановый гель сефадекс используется в колоночной хроматографии как молекулярное сито.

12

Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год

Эндоклеточные полисахаридызапасные питательные вещества клетки (крахмал, гликоген и др.). Липополисахарид (ЛПС) - один из основных компонентов клеточной стенки грамотрицательных бактерий, это

соединение липида с полисахаридом. ЛПС состоит из комплекса: 1.Липид А. 2.Одинаковое для всех грамотрицательных бактерий полисахаридное ядро. 3.Терминальная сахаридная цепочка (О- специфическая боковая цепь). Синонимы ЛПСэндотоксин, О- антиген.

ЛПС выполняет две основные функцииопределяет антигенную специфичность и является одним из основных факторов патогенности. Этоэндотоксин, токсические свойства которого проявляются преимущественно при разрушении бактериальных клеток. Его токсичность определяется липидом А. ЛПС запускает синтез более 20 биологически активных веществ, определяющих патогенез эндотоксикоза, обладает пирогенным действием.

Нуклеиновые кислоты- ДНК и РНК. Рибонуклеиновые кислоты (РНК) находятся главным образом в рибосомах (р-РНК- 8085%), т(транспортные)- РНК10%, м(матричные)- РНК- 1- 2%, главным образом в одноцепочечной форме. ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) может находиться в ядерном аппарате (хромосомная ДНК) или в цитоплазме в специализированных образованияхплазмидахплазмидная (внехромосомная) ДНК. Микроорганизмы отличаются по структуре нуклеиновых кислот, содержанию азотистых оснований. Генетический код состоит всего из четырех букв (оснований) - А (аденин), Т (тимин), Г (гуанин) и Ц (цитозин). Наиболее часто для характеристики микроорганизмов используют как таксономический признак процентное соотношение Г/Ц, которое существенно отличается у различных групп микроорганизмов.

Микроорганизмы синтезируют различные ферменты- специфические белковые катализаторы. У бактерий обнаружены ферменты 6 основных классов.

1.Оксидоредуктазыкатализируют окислительновосстановительные реакции.

2.Трансферазыосуществляют реакции переноса групп атомов.

3.Гидролазыосущесвляют гидролитическое расщепление различных соединений.

4.Лиазыкатализируют реакции отщепления от субстрата химической группы негидролитическим путем с образованием двойной связи или присоединения химической группы к двойным связям.

5.Лигазы или синтетазыобеспечивают соединение двух молекул, сопряженное с расщеплением пирофосфатной связи в молекуле АТФ или аналогичного трифосфата.

6.Изомеразы - определяют пространственное расположение групп элементов.

В соответствии с механизмами генетического контроля у бактерий выделяют три группы ферментов:

-конститутивные, синтез которых происходит постоянно;

-индуцибельные, синтез которых индуцируется наличием субстрата;

-репрессибельные, синтез которых подавляется избытком продукта реакции.

Ферменты бактерий делят на экзо- и эндоферменты. Экзоферменты выделяются во внешнюю среду, осуществляют процессы расщепления высокомолекулярных органических соединений. Способность к образованию экзоферментов во многом определяет инвазивность бактерийспособность проникать через слизистые, соединительнотканные и другие тканевые барьеры.

Примеры: гиалуронидаза расщепляет гиалуроновую кислоту, входящую в состав межклеточного вещества, что повышает проницаемость тканей (клостридии, стрептококки, стафилококки и многие другие микроорганизмы); нейраминидаза облегчает преодоление слоя слизи, проникновение внутрь клеток и распространение в межклеточном пространстве (холерный вибрион, дифтерийная палочка, вирус гриппа и многие другие). К этой же группе относятся энзимы, разлагающие антибиотики.

В бактериологии для дифференциации микроорганизмов по биохимическим свойствам основное значение часто имеют конечные продукты и результаты действия ферментов. В соответствии с этим существует микробиологическая (рабочая) классификация ферментов.

1.Сахаролитические.

2.Протеолитические.

3.Аутолитические.

4.Окислительновосстановительные.

5.Ферменты патогенности (вирулентности).

Ферментный состав клетки определяется геномом и является достаточно постоянным признаком. Знание биохимических свойств микроорганизмов позволяет идентифицировать их по набору ферментов. Основные продукты ферментирования углеводов и белковкислота, газ, индол, сероводород, хотя реальный спектр для различных микроорганизмов намного более обширный.

Основные ферменты вирулентностигиалуронидаза, плазмокоагулаза, лецитиназа, нейраминидаза, ДНК-аза. Определение ферментов патогенности имеет значение при идентификации ряда микроорганизмов и выявления их роли в патологии.

Ряд ферментов микроорганизмов широко используется в медицине и биологии для получения различных веществ (аутолитические, протеолитические), в генной инженерии (рестриктазы, лигазы).

Тинкториальные свойствабактерий (лат. tinctura, от tingo - окрашиваю) способность к окрсаке: восприимчивость к окраске, кислото-спирто-щелочеустойчивость, равномерность окраски, метахроматичность, отношение к окраске

13

Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год

по методу Грама.

Восприимчивость к окраскеу большинства видов бактерий является высокой, они легко и быстро воспринимают окраску. Как правило, перед окраской бактерии фиксируют в пламени или химическими фиксаторами, в результате чего бактерии погибают и лучше воспринимают красители. При окраске в живом состоянии ферментные системы бактерий могут разрушать и обесцвечивать краситель, оттого прижизненное (витальное) окрашивание редко применяется в микробиологии.

Отдельные структурные элементы бактериальной клетки по-разному воспринимают красители. Споры и капсулы, которые имеют дифференциальное значение плохо воспринимают красители и не окрашиваются при обычных методах окраски. Но, их можно заметить в обычных окрашенных препаратах: спора видна как светлое тельце на фоне окрашенной цитоплазмы или ее остатков, капсула в виде светлого ореола на окрашенном фоне препарата вокруг интенсивно окрашенного тела бактерий. Разработаны и используются в диагностической практике специальные сложные методы окраски спор и капсул, с которыми студенты знакомятся на практических занятиях.

Не воспринимают окраски в обычных условиях некоторые бактерии, которые являются кислото-спирто- щелочеустойчивыми,то есть не погибают при действии растворенных кислот, щелочей и спирта. К ним относятся микобактерии туберкулеза, проказы, некоторых актиномицеты. Кислотоустойчивость этих бактерий обусловлена высоким содержанием липидов, наличием миколовых кислот и физико-химическими особенностями их клеточной стенки. У микобактерий до 40 % сухого остатка составляют липиды. Выявленные три фракции липидов: фосфатидная (растворимая в эфире), жировая (растворимая в эфире и ацетоне) и восковая (растворимая в эфире и хлороформе).

Кислотоустойчивость является дифференциально-диагностическим признаком и используется для выявления и идентификации бактерий. Кислотоустойчивость бактерии окрашивают интенсивным методом – концентрированным раствором карболового фуксина при подогревании. Восприняв красную окраску, кислотоустойчивые бактерии не обесцвечиваются при обработке кислотой, щелочью или спиртом. Поэтому после окраски фуксином препарат дифференцируют 5 - 10 % серной кислотой или подкисленным спиртом и после промывания водой дополнительно окрашивают обесцвеченные кислоточувствительные микроорганизмы контрастным красителем, например метиленовым синим.

Равномерность окраски. Большинство патогенных бактерий окрашивается равномерно, причем детали внутренней структуры бактериальной клетки не оказываются. Часто видимая гомогенность окраски обусловлена тем, что краситель интенсивно связывается с оболочками клетки и маскирует окраску внутренних структур. Например, только при использовании очень разбавленных растворов кристаллвиолета удается получить избирательное окрашивание гранул волютина, в то время, как краситель в обычной концентрации дает равномерную окраску клетки. Однако, некоторые бактерии (палочки чумы) и при обычных методах окраски могут окрашиваться биполярно, в виде «английской булавки}, то есть более интенсивно по полюсам, а центр остается слабоокрашенным. Неравномерно окрашиваются также спороносные палочки, поскольку спора не проокрашивается.

Методы окраски мазков Простой метод. Фиксированный мазок окрасить каким-либо одним красителем, например фуксином водным (1-2

мин) или метиленовым синим (3-5 мин), промыть водой, высушить и микроскопировать.

Сложные методы. Последовательно нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоты и др. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других.

Окраска по Граму является сложным методом.

На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 1-2 мин ее снять, а краситель слить.

Нанести раствор Люголя на 1-2 мин.

Обесцветить этиловым спиртом в течение 30-60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя. Промыть водой.

Докрасить водным раствором фуксина в течение 1-2 мин, промыть водой, высушить и микроскопировать. Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные - в красный.

Окраска по Бурри (обнаружение капсул).

Для обнаружения капсул используют негативную окраску, т.к. окрашивается пространство между бактериями. Таким образом, образуется темное поле с неокрашенными бактериями.

Смешать на предметном стелке немного капсульной культуры и каплю разведенной (1:9) туши;

Высушить на воздухе и бактериоскопировать.

14

Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год

Модификация по Бурри-Гинсу включает создание фона краской конгорот, последующую фиксацию в 5% растворе соляной кислоты, дополнительную окраску водным фуксином. В результате – общий фон темный, капсулы бесцветны, сами бактерии – красные.

Метод Ожешко.

нанести несколько капель 0,5% соляной кислоты на нефиксированный мазок и нагреть до появления паров (2- 3 минуты);

слить кислоту, промыть водой, высушить;

зафиксировать в пламени;

окрасить по методу Циля-Нильсена (при этом споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы – в синий). Часто для окраски спор используют только метод Циля-Нильсена.

Окраска включения волютина (по Нейссеру).

Окрасить мазок уксуснокислой синькой Нейссера (2-3 минуты);

Промыть;

Окрасить раствором Люголя (30 секунд);

Слить раствор Люголя и окрасить везувином (1 минута)

Промыть препарат и высушить

Цитоплазма клетки, имеющая кислую реакцию, принимает желтый цвет. Зерна волютина – темно-синие, почти черные.

Окраска по Цилю-Нильсену. Методика:

нанести несколько капель карболового фуксина на фиксированный мазок. Покрытый фильтровальной бумагой, и подогреть до появления паров (3-5 минут);

бумагу снять, мазок охладить и обесцветить 3% серной кислотой или 3% солянокислым спиртом (3-4 секунды);

тщательно промыть водой;

окрасить дефферовской синькой (3-5 минут);

промыть водой и высушить.

Окаска спор. Зрелая спора с трудом поддается окрашиванию из-за низкой проницаемости стенки. При окраске по Граму спорообразующей культуры краска воспринимается только вегетативной частью микроба, а спора остается бесцветной. Проницаемость ее клетки резко увеличивается после обработки горячей соляной кислотой или при испольщовании концентрированного раствора краски в подогревом. Восприняв краску, спора при последующей обработке кислотой не обесцвечивается, в то время как вегетативные клетки немедленно отдают краску.

9. Физиология микробов.питание и дыхание прокариотов.культивирование аэробных и анаэробных бактерий. значение окислительно-востановительного потенциала(rH2)среды и методы его измерения.

Лекция № 4. Физиология и принципы культивирования микроорганизмов.

Метаболизм микроорганизмов.

Для роста и размножения микроорганизмы нуждаются в веществах, используемых для построения структурных компонентов клетки и получения энергии. Метаболизм (т.е. обмен веществ и энергии) имеет две составляющих - анаболизм и катаболизм. Анаболизмсинтез компонентов клетки (конструктивный обмен). Катаболизм энергетический обмен, связан с окислительно-восстановительными реакциями, расщеплением глюкозы и других органических соединений, синтезом АТФ. Питательные вещества могут поступать в клетку в растворимом виде (это характерно для прокариот)- осмотрофы, или в виде отдельных частиц - фаготрофы.

Основным регулятором поступления веществ в бактериальную клетку является цитоплазматическая мембрана. Существует четыре основных механизма поступления веществ: -пассивная диффузия- по градиенту концентрации, энергонезатратная, не имеющая субстратной специфичности;

-облегченная диффузия - по градиенту концентрации, субстратспецифичная, энергонезатратная, осуществляется при участии специализированных белков пермеаз;

-активный транспорт - против градиента концентрации, субстратспецифичен (специальные связывающие белки в комплексе с пермеазами), энергозатратный (за счет АТФ), вещества поступают в клетку в химически неизмененном виде;

-транслокация (перенос групп)- против градиента концентрации, с помощью фосфотрансферазной системы, энергозатратна, вещества (преимущественно сахара) поступают в клетку в форфорилированном виде.

Основные химические элементыорганогены, необходимые для синтеза органических соединений - углерод, азот, водород, кислород.

В зависимости от источника потребляемого углерода микробы подразделяют на аутотрофы (используют CO2) и гетеротрофы (используют готовые органические соединения). В зависимости от источника энергии

15

Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год

микроорганизмы делят на фототрофы (энергию получают за счет фотосинтеза - например, цианобактерии) и хемотрофы (энергия добывается за счет химических, окислительно-восстановительных реакций). Если при этом донорами электронов являются неорганические соединения, то это литотрофы, если органические - органотрофы. Если бактериальная клетка в состоянии синтезировать все необходимые для жизнедеятельности вещества, то это прототрофы. Если бактерии нуждаются в дополнительных веществах (факторах роста), то это ауксотрофы. Основными факторами роста для труднокультивируемых бактерий являются пуриновые и пиримидиновые основания, витамины, некоторые (обычно незаменимые) аминокислоты, кровяные факторы (гемин) и др.

Дыхание микроорганизмов.

Путем дыхания микроорганизмы добывают энергию. Дыхание - биологический процесс переноса электронов через дыхательную цепь от доноров к акцепторам с образованием АТФ. В зависимости от того, что является конечным акцептором электронов, выделяют аэробное и анаэробное дыхание. При аэробном дыхании конечным акцептором электронов является молекулярный кислород (О2), при анаэробном - связанный кислород ( -NO3 , =SO4, =SO3).

Примеры.
	О2
Аэробное дыхание донор водорода	H2O
Анаэробное дыхание
нитратное окисление	NO3
(факультативные анаэробы) донор водорода	N2
сульфатное окисление	SO4
(облигатные анаэробы) донор водорода	H2S

По типу дыхания выделяют четыре группы микроорганизмов.

1.Облигатные (строгие) аэробы. Им необходим молекулярный (атмосферный) кислород для дыхания. 2.Микроаэрофилы нуждаются в уменьшенной концентрации (низком парциальном давлении) свободного

кислорода. Для создания этих условий в газовую смесь для культивирования обычно добавляют CO2, например до 10процентной концентрации.

3.Факультативные анаэробы могут потреблять глюкозу и размножаться в аэробных и анаэробных условиях. Среди них имеются микроорганизмы, толерантные к относительно высоким (близких к атмосферным) концентрациям молекулярного кислорода - т.е. аэротолерантные, а также микроорганизмы которые способны в определенных условиях переключаться с анаэробного на аэробное дыхание.

4.Строгие анаэробы размножаются только в анаэробных условиях, т.е. при очень низких концентрациях молекулярного кислорода, который в больших концентрациях для них губителен. Биохимически анаэробное дыхание протекает по типу бродильных процессов, молекулярный кислород при этом не используется.

Аэробное дыхание энергетически более эффективно (синтезируется большее количество АТФ).

В процессе аэробного дыхания образуются токсические продукты окисления (H2O2- перекись водорода, -О2 - свободные кислородные радикалы), от которых защищают специфические ферменты, прежде всего каталаза, пероксидаза, пероксиддисмутаза. У анаэробов эти ферменты отсутствуют, также как и система регуляции окислительно-восстановительного потенциала (rH2).

Основные методы создания анаэробных условий для культивирования микроорганизмов.

1.Физический - откачивание воздуха, введение специальной газовой безкислородной смеси (чаще- N2- 85%, CO2- 10%, H2- 5%).

2.Химический - применяют химические поглотители кислорода.

3.Биологический - совместное культивирование строгих аэробов и анаэробов (аэробы поглощают кислород и создают условия для размножения анаэробов).

4.Смешанный - используют несколько разных подходов.

Необходимо отметить, что создание оптимальных условий для строгих анаэробов - очень сложная задача. Очень непросто обеспечить постоянное поддержание безкислородных условий культивирования, необходимы специальные среды без содержания растворенного кислорода, поддержание необходимого окислительно-восстановительного потенциала питательных сред, взятие и доставка, посев материала в анаэробных условиях.

Существует ряд приемов, обеспечивающих более подходящие условия для анаэробовпредварительное кипячение питательных сред, посев в глубокий столбик агара, заливка сред вазелиновым маслом для сокращения доступа кислорода, использование герметически закрывающихся флаконов и пробирок, шприцев и лабораторной посуды с инертным газом, использование плотно закрывающихся эксикаторов с горящей свечой. Используются специальные приборы для создания анаэробных условий - анаэростаты. Однако в настоящее время наиболее простым и эффективным оборудованием для создания анаэробных и микроаэрофильных условий является система “Газпак” со специальными газорегенерирующими пакетами, действующими по принципу вытеснения атмосферного воздуха газовыми смесями в герметически закрытых емкостях.

10. Характеристика процессов роста и размножения у бактерий. фазы развития

16

Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год

бактериальной популяции. закономерности развития культуры на жидких пит средах. периодическое, глубинное и проточное культивирование.

Рост и размножение микроорганизмов.

Бактериальные клетки размножаются в результате деления. Основные стадии размножения микробов в жидкой среде в стационарных условиях:

-лагфаза (начальная стадия адаптации с медленным темпом прироста биомассы бактерий);

-экспоненциальная (геометрического роста) фаза с резким ростом численности популяции микроорганизмов (2 в степеии n);

-стационарная фаза (фаза равновесия размножения и гибели микробных клеток);

-стадия гибели - уменьшение численности популяции в связи с уменьшением и отсутствием условий для размножения микроорганизмов (дефицит питательных веществ, изменение рH, rH2, концентрации ионов и других условий культивирования).

Данная динамика характерна для периодических культур с постепенным истощением запаса питательных веществ и накоплением метаболитов.

Если в питательной среде создают условия для поддержания микробной популяции в экспоненциальной фазе -

это хемостатные (непрерывные) культуры.

Процесс размножения культуры микробов на несменяемой среде протекает не¬равномерно. В нем определяют четыре основные фазы.

1.Начальная фаза (лаг-фаза), или фаза покоя. В это время культура приспосабливается к питательной среде.

Вмикробной клетке увеличивается содержание РНК ис ее помощью происходит синтез необходимых фермен¬тов.

2.Экспоненциальная (логарифмическая) фаза ха¬рактеризуется максимальным увеличением клеток в культуре, оно идет в геометрической прогрессии (1, 2,4, 8, 16, 256 и т. д.). В это время в среде большинство молодых и биологически активных клеток. В конце фа¬зы, когда среда истощается, исчезают необходимые для данного микроба вещества, уменьшается количество кис¬лорода, происходит увеличение продуктов обмена — рост культуры замедляется. Кривая постепенно принимает горизонтальное направление.

3.Стационарная фаза, или период зрелости, гра¬фически представляет линию, идущую параллельно оси абсцисс. Наступает равновесие между числом вновь об¬разованных и погибших клеток. Уменьшается количе¬ство среды, увеличивается плотность клеток в попу¬ляции, усиливается токсическое действие продуктов об¬мена — все это обусловливает гибель клеток.

4.Фаза отмирания. В этой фазе наблюдается не только уменьшение, но и изменение клеток. Появляют¬ся деградированные формы, а также споры. Через не¬сколько недель или месяцев культура погибает. Так происходит потому, что ядовитые продукты жизнедея¬тельности не только тормозят, но и убивают микробные клетки.

Характер роста бактерий на плотных и жидких питательных средах: сплошной рост, образование колоний, осадок, пленка, помутнение.

Чистая культура- популяция одного вида микроорганизмов.

Основные принципы получения чистых культур: механическое разобщение, рассев, серийные разведения, использование элективных сред, особых условий культивирования (с учетом устойчивости некоторых микробов к определенным температурам, кислотам, щелочам, парциальному давлению кислорода, рН и мн.др.).

При периодическом способе производства простерилизованный ферментер заполняется питательной средой, часто уже содержащей нужные микроорганизмы. Биохимические процессы в этом ферментере продолжаются от нескольких часов до нескольких дней. При этом типе культивирования клеточная культура может пройти все фазы своего развития:

Синтез первичных метаболитов наиболее интенсивно идет с середины Log-фазы до середины стационарной. Ближе к концу стационарной фазы может начаться синтез вторичных метаболитов.

Способ глубинного культивирования бактерий применяют при промышленном выращивании бактериальной биомассы, для чего используют специальные котлы-реакторы. Они снабжены системами поддержания температуры, подачи в бульон различных питательных веществ, перемешивания биомассы и постоянной подачи кислорода. Создание аэробных условий по всей толще среды способствует протеканию энергетических процессов по аэробному пути, что способствует максимальной утилизации энергетического потенциала глюкозы и, следовательно, максимальному выходу биомассы.

Метод проточных сред Метод проточных сред (промышленный способ культивирования) позволяет постоянно поддерживать бактериальную культуру в экспоненциальной фазе роста, что достигают постоянным внесением питательных веществ и удалением определённого числа бактериальных клеток. Пребывание бактерий в экспоненциальной стадии роста обеспечивает максимальный выход различных БАВ (витамины, антибиотики и др.).

11.Характеристика и этапы бактериологического метода исследования. Питательный среды. Чистые культуры и их получение. Способы идентификации выделенной культуры

17

Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год

Чистая культура- популяция одного вида микроорганизмов.

Основные принципы получения чистых культур: механическое разобщение, рассев, серийные разведения, использование элективных сред, особых условий культивирования (с учетом устойчивости некоторых микробов к определенным температурам, кислотам, щелочам, парциальному давлению кислорода, рН и мн.др.).

Основным методом лабораторной диагностики инфекционных болезней является бактериологический метод. Суть бактериологического метода заключается в выделении возбудителей из исследуемого материала и его идентификации (определения рода, вида, разновидностей).

Бактериологический метод позволяет определить:

1.Вид возбудителя и поставить диагноз заболевания

2.Антибиотики, убивающие возбудителя и назначить соответствующее лечение

3.Фаговары и серовары возбудителя для выявления источника инфекции

Первый этап — первичный посев исследуемого материала для получения изолированных колоний. Первичный посев проводят на накопительные среды и ДДС (чашечные среды).

Второй этап — характеристика изолированных колоний и получение из них чистой культуры путем пересева на скошенный столбик основной среды.

Третий этап — идентификация чистой культуры — определение рода, вида, разновидностей возбудителя, определение антибиотикочувствительности, определение фаговаров.

Культура микроорганизмов — это бактерии, выросшие на питательных средах. Чистая культура — это бактерии одного вида, выросшие на питательных средах. Внутри вида встречаются разновидности, отличающиеся по одному признаку:

1.Морфовары — отличаются по морфологии

2.Хемовары — отличаются по биохимическим свойствам

3.Серовары — отличаются по антигенным свойствам

4.Фаговары — отличаются по чувствительности к фагам

Чистая культура необходима для проведения идентификации, определения сероваров, фаговаров, чувствительности к антибиотикам. Штамм — это бактерии одного вида, выделенные из конкретного источника (река Волга, больной Иванов и т. д.). Колония — видимое скопление бактерий одного вида, образующееся при размножении одной бактериальной клетки на плотной питательной среде.

Первый этап исследования — первичный посев исследуемого материала для получения изолированных колоний. Перед первичным посевом проводят микроскопию исследуемого материала. Исследуемый материал как правило содержит смесь различных бактерий, в том числе и возбудителей болезни. Для выделения возбудителя необходимо получить изолированные колонии (бактерии одного вида) путем подбора питательной среды и специальными методами посева.

Существует два метода получения изолированных колоний: 1. Метод Дригальского 2. Метод Коха

Основные принципы культивирования микроорганизмов на питательных средах.

1.Использование всех необходимых для соответствующих микробов питательных компонентов. 2.Оптимальные температура, рН, rH2, концентрация ионов, степень насыщения кислородом, газовый состав и

давление.

Микроорганизмы культивируют на питательных средах при оптимальной температуре в термостатах, обеспечивающих условия инкубации.

18

Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год

По температурному оптимуму роста выделяют три основные группы микроорганизмов. 1.Психрофилы - растут при температурах ниже +20 градусов Цельсия.

2.Мезофилы - растут в диапазоне температур от 20 до 45 градусов (часто оптимумпри 37 градусах С). 3.Термофилы - растут при температурах выше плюс 45 градусов.

Краткая характеристика питательных сред.

По консистенции выделяют жидкие, плотные (1,5- 3% агара) и полужидкие (0,3- 0,7 % агара) среды.

Агар- полисахарид сложного состава из морских водорослей, основной отвердитель для плотных (твердых) сред. В качестве универсального источника углерода и азота применяют пептоны- продукты ферментации белков пепсином, различные гидролизаты - мясной, рыбный, казеиновый, дрожжевой и др.

По назначению среды разделяют на ряд групп:

-универсальные (простые), пригодные для различных нетребовательных микроорганизмов (мясо - пептонный бульон - МПБ, мясо - пептонный агар - МПА);

-специальные - среды для микроорганизмов, не растущих на универсальных средах (среда МакКоя на туляремию, среда ЛевенштейнаИенсена для возбудителя туберкулеза);

-дифференциально - диагностическиедля дифференциации микроорганизмов по ферментативной активности и культуральным свойствам ( среды Эндо, Плоскирева, Левина, Гисса);

-селективные (элективные)- для выделения определенных видов микроорганизмов и подавления роста сопутствующихпептонная вода, селенитовая среда, среда Мюллера.

По происхождению среды делят на естественные, полусинтетические и синтетические.

Выделение чистой культуры

Основным методом выделения чистых культур бактерий является метод, предложенный Р. Кохом, принцип которого заключается в получении культуры бактерий из изолированных колоний. При выделении чистой культуры аэробов накопительную культуру или исследуемый материал высевают на плотную питательную среду. Порядок работы следующий. Расплавленную питательную среду разливают в стерильные чашки Петри. После того как среда застынет, на её поверхность наносят каплю исследуемого материала и стерильным шпателем Дригальского распределяют каплю сначала по одной стороне поверхности питательной среды в чашке Петри, затем по второй. Этим же шпателем протирают поверхность плотной среды во 2-й, 3-й и 4-й чашках. Чашки инкубируют при оптимальной для микробов температуре (чаще всего - 37°С) до 2-х суток. Обычно в первых двух чашках после инкубации наблюдают сплошной рост микробов, тогда как в последующих - изолированные колонии.

Рассеивать накопительную культуру можно методом истончающегося штриха. В этом случае накопительную культуру или её разведение отбирают петлей и проводят штрихи по плотной питательной среде в чашке Петри в определенном порядке. Перед каждым новым штрихом петлю стерилизуют. Чашки термостатируют 1-7 суток в зависимости от скорости роста микроорганизма. Выросшие изолированные колонии методом штриха отсевают петлей в пробирки на поверхность скошенной среды или в жидкую среду.

Изолированные колонии анаэробов и факультативных анаэробов получают методом глубинного посева. С этой целью в пробирки с расплавленной питательной средой, охлажденной до 40-37°С, высевают по 0,5-1,0 мл разведения исследуемого материала с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии. Среду быстро охлаждают и заливают поверхность слоем стерильной смеси парафина и вазелинового масла. Можно использовать капиллярные пипетки Пастера, в которые набирают соответствующее разведение агаризованной среды с посевом. Конец капилляра запаивают. При удачно выбранном разведении в пробирке или пипетке вырастают изолированные колонии. Для их извлечения пробирку (или пипетку) слегка нагревают, быстро вращая над пламенем горелки или быстро опустив в теплую воду, при этом агар, прилегающий к стенке, плавится и содержимое столбика легко выскальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара разрезают стерильным скальпелем и извлекают колонии, захватывая их стерильной капиллярной пипеткой или петлей. Извлеченные колонии переносят в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов. Если изолированные колонии получены в капилляре, то после тщательной дезинфекции его разламывают стерильным пинцетом и участки капилляра, содержащие изолированные колонии, переносят в стерильную среду.

Определение чистоты выделенной культуры

Чистота колоний, отсеянных на косой агар, может быть проверена несколькими способами: визуальным, контролем под микроскопом и высевом на ряд питательных сред. При визуальном контроле просматривается рост микроорганизмов по штриху на поверхности скошенной питательной среды. Если рост по штриху неоднороден, то культура считается загрязненной. Однако, такой контроль возможен только для культур, способных расти на поверхности плотных питательных сред. Поэтому чистоту культуры обязательно нужно контролировать под микроскопом. Для этого готовят препарат окрашенных клеток и просматривают его с иммерсией. Чистая культура должна быть морфологически однородна и может иметь лишь незначительное варьирование размеров клеток. Определение систематического положения бактерий включает изучение совокупности признаков: морфологических, культуральных и физиолого-биохимических.

Культуральные признаки

19

Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год

К культуральным или макроморфологическим признакам относятся характерные особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах.

Рост на плотных питательных средах.

На поверхности плотных питательных сред микробы могут расти в виде колоний, штриха или сплошного газона. Колонией называется изолированное скопление клеток одного вида, выросшее в большинстве случаев из одной клетки. В зависимости от того, где развивались клетки, различают поверхностные, глубинные и донные колонии. Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются большим разнообразием. При их описании учитывают следующие признаки:

форму колоний - округлая, амёбовидная, неправильная, ризоидная и т.д.; поверхность колонии - гладкая, шероховатая, бороздчатая, складчатая, морщинистая, радиально исчерченная, с концентрическими кругами;

профиль колонии - плоский, выпуклый, кратерообразный, конусовидный, выпуклый в центре с валиком по краю, вдавленный в центре, с валиком по краю и др.; блеск и прозрачность - блестящая, матовая, тусклая, мучнистая, прозрачная;

цвет колонии - бесцветная (грязно-белые колонии относят к бесцветным) или пигментированная - белая, жёлтая, золотистая, оранжевая, сиреневая, красная, чёрная. Особо отмечают выделение пигмента в субстрат; край колонии - ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый, корневидный и др.;

структуру колонии - однородная, мелко- и крупнозернистая, струйчатая (край и структуру колонии определяют с помощью лупы или при малом увеличении микроскопа); консистенцию колонии - её определяют, прикасаясь к колонии петлей. Колония может легко сниматься с агара,

быть плотной, мягкой, врастающей в агар, слизистой (прилипает к петле), тягучей, пленчатой (снимается целиком), хрупкой.

Глубинные колонии довольно однообразны. Чаще всего они похожи на сплющенные чечевички, в проекции имеющие форму овалов с заостренными концами. Колонии немногих бактерий напоминают пучки ваты с нитевидными выростами в среду. Образование глубинных колоний часто сопровождается разрывом плотной среды, если микробы образуют газы. Донные колонии самых разнообразных микроорганизмов имеют вид тонких прозрачных пленок, стелящихся по дну.

Размеры и некоторые другие признаки колоний меняются с возрастом и зависят от состава среды, поэтому при их описании указывают возраст культуры, состав среды, температуру культивирования.

При описании роста микроорганизма по штриху отмечают следующие особенности: рост скудный, умеренный или обильный, сплошной с ровным или волнистым краем, четко видный, напоминающий цепочки изолированных колоний, диффузный, перистый, древовидный или ризоидный. Характеризуют оптические свойства налета, его цвет, поверхность и консистенцию.

Рост на жидких питательных средах.

Различают следующие формы роста бактерий на жидких питательных средах:

Помутнение среды. Такой рост характерен для многих патогенных микробов, относящихся к группе факультативных анаэробов.

Придонный рост. Характеризуется образованием осадка на дне пробирки. Он может быть скудным или обильным, крошковидным, гомогенным, волокнистым или в виде крупных рыхлых хлопьев. Консистенция осадка бывает вязкая, слизистая, хрупкая или пастообразная. Если культура не образует пигмента, то цвет среды не изменяется и осадок приобретает серовато-белый или желтоватый цвет. Придонный рост характерен для бактерий с анаэробным типом дыхания.

Пристеночный рост бактерий выражается в том, что питательная среда, находящаяся в пробирке, остаётся прозрачной. Бактерии растут в виде крупных рыхлых хлопьев или компактных зёрен, прикреплённых к внутренней поверхности стенок пробирки.

Поверхностный рост бактерий характеризуется появлением на поверхности жидкой питательной среды плёнки. Плёнка может быть тонкой, бесцветной, исчезающей при встряхивании или взбалтывании, влажной, вязкой, слизистой, плотной, сухой, при взятии с неё материала сниматься целиком в виде круглого диска. Нередко рост микроорганизмов в жидкой питательной среде сопровождается появлением газа и запаха.

12. Морфология и анатомия микроскопических грибов и спирохет. Особенности метаболизма и принципы культивирования спирохет, грибов.

Морфологическая характеристика грибов.

Грибы и простейшие имеют четко ограниченное ядро и относятся к эукариотам. Грибы крупнее бактерий, в эволюционном плане близки к растениям (наличие клеточной стенки, содержащей хитин или целлюлозу, вакуолей с клеточным соком, неспособность к перемещению, видимое движение цитоплазмы). Ядерный материал грибов отделен от цитоплазмы ядерной мембраной. Дрожжевые грибы образуют отдельные овальные клетки. Плесневые грибы формируют клеточные нитеподобные структуры- гифы. Мицелий- переплетение гифов - основная морфологическая структура. У низших грибов мицелий одноклеточный, не имеет внутренних перегородок (септ).

20

Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год

Грибы размножаются половым и бесполым (вегетативным) способом. При вегетативном размножении образуются специализированные репродуктивные структурыспоры- конидии. Они могут располагаться в специализированных вместилищах- спорангиях (эндоспоры) или отшнуровываться от плодоносящих гиф (экзоспоры). Реже наблюдают образование спор внутри клеток (оидии), являющихся сегментами гиф. Дрожжевые клетки размножаются почкованием, мицелий не образуют. Половое размножение включает взаимодействие специализированных клеток, имеющих существенные различия в морфологии у различных грибов и часто используемых как дифференциальнодиагностический признак.

Для большинства видов грибов, имеющих медицинское значение, характерно наличие конидий (или экзоспор), являющихся формами неполового размножения. Их классификация во многом основывается на морфологических формах конидий. Их наиболее частые формы- бластопоры, хламидоспоры, артроспоры, конидиоспоры.

Бластоспорыпростые структуры, котрые образуются в результате почкования, с последующим отделением почки от родительской клетки, например у дрожжевых грибов.

Хламидоспоры образуются в результате увеличения гифальных клеток с образованием толстой оболочки, защищающей споры от неблагоприятных условий окружающей среды.

Артроспорыспоры, образующиеся путем фрагментации гиф на отдельные клетки. Они встречаются у дрожжеподобных грибов, возбудителя кокцидиоидоза, тканевых форм дерматофитов в волосе, кожных чешуйках и в ногтях.

Конидиоспорызрелые наружные споры, возникающие на дифференцированных конидиофорах (конидионосцах), отличающихся от других нитей мицелия по форме и размерам (у аспергилл, пеницилл) или располагающиеся по бокам и на концах любой ветви мицелия, прикрепляясь к ней непосредственно или тонкой ножкой.

К эндоспорам совершенных грибов относятся спорангиоспоры мукоровых грибов, развивающихся в специальных органах (спорангиях), располагающихся на вершине спорангиеносца. Споры освобождаются при разрыве стенки спорангия.

Эндоспоры обнаруживают также у тканевых форм возбудителей кокцидиоидоза. Они развиваются в круглых образованиях - сферулах, при разрыве стенки зрелой сферулы попадают во внешнюю среду.

Основное функциональное отличие спор у бактерий и грибов: у бактерий споры обеспечивают переживание в неблагоприятных условиях окружающей среды, у грибов образование спорспособ размножения.

Сиирохетыэто прокариоты, относящиеся к бактериям. Спирохеты имеют следующие осо­бенности

1.Форма - извитая, как у спирилл.

2.Строение: имеется податливая клеточная стенка, цитомембрана, нуклеоид, миофибриллы.

3.Размножение - поперечным делением.

4.Имеют черты, сближающие их с простейшими:

а) передвижение происходит при помощи миофибрилл, что обеспечивает их движение - поступательное, сгибательное, вращательное, маятникообразное

б) окрашивание по Романовскому-Гимзе; в) заболевание по характеру течения напоминает протозойные (вызванные простейшими);

г) сходные механизмы заражения (в том числе наличие переносчиков - членистоногих); д) чувствительны к антибиотикам и к препаратам, применяемым для лечения протозойных заболеваний.

Спирохеты Гр-. По типу питания - гетеротрофы. По типу дыхания боррелии и трепонемы - анаэробы, а лептоспиры - аэробы. Патогенные спирохеты относятся к 3 родам:

1. Род Боррелия (имеют 3-5 неравномерных завитков):

а) возбудитель эпидемического вшивого возвратного тифа (B.recurrentis);

б) возбудители клещевых возвратных тифов - (B.caucasica). Культивируется плохо (на культурах тканей, на средах с сывороткой и кусочками тканей)

2. Род Трепонема (имеют 8-12 равномерных завитков, в виде пружины):

а) возбудитель сифилиса - (бледная трепонема), T.pallidum. Культивируется в яичке кролика. 3. Род Лептоспира (имеют множество мелких завитков; концы загнуты и имеют утолщения).

Патогенные лептоспиры относятся к виду L.interrogans. Культивируются на среде Уленгута (водопроводная вода + 30% кроличьей сыворотки).

Морфологию спирохет обычно изучают в неокрашенном состоянии, наблюдая подвижность в ультрамикроскопе или

вокрашенном состоянии (чаще по Романовскому-Гимзе).

13.Микрофлора почвы, воды, воздуха, бытовых и медицинских объектов; методы исследования. выживаемость патогенных микробов во внешней среде.

Роль микроорганизмов в круговороте веществ в природе.

Под круговоротом веществ в природе понимают циклы превращения химических элементов, из которых построены живые существа, происходящие вследствие разнообразия и гибкости метаболизма микроорганизмов.

Наибольшее значение для всего живого имеет обмен (кругооборот) углерода, кислорода, водорода, азота, серы,