Material_mikra_2015_by_zOrg

41

Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год

1)Ориен-я р-я на стекле:стяв-ся когда болезнь м.б.выз-на раз.видами микробов,для облег-я работы ставят проверено ориен-ю р-ю(при лаб.диаг.бюш.тифа,паратифов)на пред.ст.наносят сыв.,развед-ю 1:10 или 1:25,разв-т в физ.р-ре,покач-т ст.в те.2-3мин.,до появ-я агглют-и.Набл-т за появ-м зерен аглютината в кап-х.

2)развер-я р-я Грубера:ставят с 1 сыв.,реагир-й препол-но в ориен-й р-ии.(ставят для окон-йт идентиф-ии и

опред.титра)для вып.данной р-ии надо взять аггл.сыв.с указанным титром.Из основного развед-я аггл.сыв.готовят ряд послед-х двукрат-х разв-й сыв-ки до титра,берут ряд проб-к ,в т.ч.и контр-е,во все вносят по 1 мл физ.р-ра,затем в 1 пр.вносят 1 мл осн-го рзв-я аггл.сыв.,после из 1 проб.берут 1 мл сыв.и переел-т во 2-ю и т.д.,и титруем до ого разв-я кот.б.указан на ампуле После пригот-я сыв.в каждую прою-ку вносят взвесь микробов,встряхивают,в тер-т на 18-20ч.Р-я счит.+если аггл-я микробов наст-т при разв-ии сыв.от 2\3титра и до ее окон-гог титра.

Р-я кастеллани-р-я истощения-для получ.моновал.сыв.-устранить групповую аггл-ю можно,удалив из сыв.АТ в отнош-е АГ,явл-ся общими для гомолог.микрба.Это дост-ся путем смешивания густой взвеси микробов и сыв.,дающих групп.аггл-ю.,что ведет к адсорб-ии на их пов-ти АТ.

Р-я Видаля-для диаг.брыш.тифа и всех видо в тифов(для обнар-я любого инф-го забол-я).Исп-т:исслед.сыв.,0,85% р- р NaCl ,АГ-диаг-м.Диаг-м-взвесь в р-ре убитых микробов,сохр-х свою АГ стр-ру.Сначала гот-т осн-е разв-е в зав-ти от титра,затем дел-т серию разв-й путем послед-го преноса из 1 проб.в др.1 мл.В контр-й проб.вносят изотон-й р-р NaCl,затем в каждую проб.вносят микробы,проб.встряхивают и в термостат.Р-я счит.+ если аллг-я выражена не менее 2-мя ++.

Р-я преципитации:для диаг-ки ряда инф.забол-й б.и вирусов:сиб.язвы,чумы,натур.оспы,полимиелита. К р-ии прецип.отн-ся АГ-мелка частица(ДНК,б.,лек-во,яд)при доб-ии АТ проис-т помут-е р-ра,только в зоне эквив-ти.Вып-е нераствор-гог комплекса:АГ-АТ в виде осадка набл-ся при эквив-х соотн-х ингредиента.

1)Р-я кольцо прец-ии-еси на столбик с АТ осторожно наслаив-ть АГ,то на грание обаз-ся кольцо(осторожно насл-ть для попад-я в зону экв-ти)-узкая проб-ка вносит 0,2мл прецмп.сыв-ки,пипеткой медл-но насл-т 0,1мл р-раАГ. Через 2-3 мин.в случае +р-ии на границе между сыв.и исслед.АГ появ-ся преципитат в виде белого кольца.

2)П-я пре-ии в агаре: Ча-ки залив.агаром,в кот.вырез-т несл.луночект на равном раст.др.от др.В центр вносят сыв.сод-ю АТ,в ост-е –АГ. На месте встречи АГ-АТ –мутные полоски-дуги прец-ии.Позв-т опред-ть токсигенность исслед.б.(напр.дифтер.палочку)с пом.антитоксич.сыв.

3)Р-я имунофлюоресценции:к АГ+АТ(меченые флюрохромом)-образ-ся светящийся комп-с-обнар-ся при люмин-й микроскопии.Цель:для почсчета лимф-в,для опред-я формы обьекта,локал-ии на среде тк. и т.д.

Р-я связыв-я компл-та-исп-т компл-т кт.сод-ся в сыв.кр.морс.свинки.мГемолит-я акт-ть комп-та термолаб-на и послтью утрачена при прогревании сыв.в теч.30мин.при 56*С.При адсорб-ии комп-та на комп-се АГ-АТ его дейс-е проявся в р-ии лизиса АГ.Для учета рез-в вводят гемолит-ю с-му. Она сост-т из взвеси эр-в барана в изотон.р-ре хлорина натрия и гемолит.сыв.кролика.Полож-я р-я –хар-ся здержкой гемолиза вслед-ии адсорб-ии комп-та с-мо АГ- АТ.отриц.р-я-хар-ся налич-м гемолиза,т.к.своб-й комп-т связ-ся с сис-й эр-ты барана-гемол-я сыв.кролика.РСК облад- т высокой чуст-тью и спец-тью,что позв-т ее исп-ть для серодиаг-ки многих забол-й,а также для выяв-я АГ в кр.боьного.

Р-я Кумбса:

Позв-т обнар-ть неполные АТ,блокир-е или тормозящие аглют.АТ.1)непрямой м.-уст.нал-е несвяз-х АТ в сыв.больного 2)прямой м.-уст-т нал-е в кр.больных АТ,связ-х с эр-митех-к апост-ки:1)опыткая проб-ка: эр-ты больного+антиглоб-я сыв. 2)контрольная:эр-ты+норм-я сыв.+антиглоб.сыв. 3)исслед.сыв.+эр-ты(без резус АГ)+Антиглоб.сыв.

28. Серологический метод дигностики инфекционных болезней. Современные приёмы сородиагностики. Иммунофлюорисцентный, иммуноферментный и радиационный анализ

В микробиологической практике нашли широкое применение реакции взаимодействия антигенов с иммунными сыворотками. Эти реакции получили название серологических, так как для их постановки используют сыворотку (serum), содержащую антитела.

42

Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год

Данные антитела появляются в сыворотке в ходе иммунного ответа макроорганизма на внедрение в него микроорганизмов, несущих определенные чужеродные антигенные комплексы. Однако следует особо подчеркнуть тот факт, что для обнаружения проникновения и колонизации микробами макроорганизма используют не только сыворотки, полученные от больных, но также определяют наличие антигенов микроорганизмов, что дает возможность идентификации возбудителей инфекционных заболеваний.

Существует много разновидностей этих реакций, но в настоящем пособии будут представлены лишь основные из них, поскольку некоторые реакции, несмотря на их высокую информативность, применяются сейчас уже гораздо реже, чем это было ранее, например – определение опсонического индекса (в диагностике бруцеллеза, сыпного тифа и др.), реакция Исаева-Пфейффера (в диагностике холеры) и др.. Связано это в первую очередь с появлением новых методов обнаружения антигенов, антител и их комплексов, что позволяет быстро и точно выполнять идентификационные мероприятия и ставить диагноз заболевания с использованием современного лабораторного оборудования.

ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУНОМИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ Все иммуномикробиологические методы (ИМ) можно подразделить на 3 группы:

I. ИМ, основанные на прямом взаимодействии антигена с антителом (реакции агглютинации, преципитации, гемагглютинации, иммобилизации и др.);

II. ИМ, основанные на опосредованном взаимодействии антигена с антителом (реакции непрямой гемагглютинации, коагглютинации, латекс-агглютинации, угольной агломерации, бентонит-агглютинации, связывания комплемента и др.);

III. ИМ с использованием меченых антител или антигенов (метод флюоресцирующих антител, иммуноферментный и радиоиммунный анализы, спиниммунологический и другие методы).

При протекании реакций в иммунологических методах характерно наличие следующих фаз:

1)специфическая (невидимая) фаза – связывание детерминантной группы (эпитопа) антигена с паратопом - активным центром иммуноглобулина;

2)неспецифическая (видимая) фаза – образующийся комплекс антиген+антитело утрачивает растворимость и выпадает в осадок в виде хлопьев. Однако это явление возможно лишь в электролитной среде, например в 0,85% растворе натрия хлорида.

31.Р-я имунофлюоресценции.Имунофер.анализ,имуноблотинг:

Имунофлюорес-й анализ-явл-ся экспресс-диаг-й,высокочувс-й.

Выд-т 2 метода:

1)Прямой м.-(м.Кунса)- к исслед-й взвеси микробов,фиксир-й на стекле доб-т сыв-ку,меченую флюрохромом(изотиоцианит флуоресцеина),образ-ся комп-с АГ-АТ при освечение УФ дает ярко зел.цв. 2)непрямой м.-исп-т в осн-м диагн-е сыв.против к-л микроба,доб-е этой сыв.к используемой взвеси микробов выз-т образ-е комп-са АГ-АТ.Этот комп-с выяв-ся с пом.универ-й флуоресц-й сыв.,сод-й АТ гамма-глоб-й фракции кр.того вида жив.,от кот.была пол-на диагн-я сыв-ка. Свят-йся комп-с выяв-т при люминесцентом микроскопии. Непрямой м. можно исп-ть для выяв-я АТ в сыв.кр.

Имунофер-й анализ: наиб.широко расп-й имунол-й метод. Выд-т неск.методов:

1)Прямой твердофазный ИФА: сыв.инкуб-т с АГ,фикс-м на тв.суб-те,после инкуб-ии АТ несвяз-ся с АГ удал-т многократным промыв-м.Далее вносят меченую фер-м антисыв.к АТ-м,связав-ся с АГ.Оценка рез-та:опред-т кол-во фер-та-маркера,кот.связ-н с АТ.

2)Конкурентный твердофазный ИФА:позв-т непоср-н регист-ть АГ с АТ,а не анал-ть 2-е его измен-я.Метод отл-ся высой чувс-тью-от 70-90% для разл-х возб-й.сущ-т в 2-х вар-х:

а)с АТ-позит-й сыв.,т.е.в ней есть спец-е АТ к АГ,фикс-му на пов-ти твер.фазы микропланшетки.Мех-м:спец.тела в исслед-й сыв.связ-т с АГ,фиксир-й на тв.суб-те.Спец-е тела меченные фер-м не взаим-т со свя-ми АГ-сод-е маркера низкое.

б)АТ-негативной сыв.(в ней нет спец.АТ к исслед-му АГ).Мех-м: неспецюАТ в исслед.сыв.не связ-т АГ,фиксир-е на тв.суб-те Спец-е АТ,меченые фер-м взам-т со связ-ми АГ-сод-е маркера высокое.

Имуноблоттинг:метод идентификации Аг с пом.соов-х сыв.На практике прим-т для идентиф-ии Аг ВИЧ. Мех- м:сначала электрофорезом в полиакриловом геле выд-т Аг вируса,затем на полосу преципитата наклад-т

43

Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год

носитель(нитроцел-ю пленку)и продол-т электрофорез.После чего на пленку наносят сыв.пациента и инкуб-т.После отмывания несвяз-х АТ проводят ИФА-на пленку наносят Антисыв.к Ig чел-ка,меченую фер-м,и хромогенный суб- т,измен-й окраску при взам-ии с фер-м.При нал-ии комп-са АГ-АТ-антисыв-ка к Ig на носителя пов-ся окраш-е пятна.

29. Иммунопрофилактика, иммунотерапия и иммунокоррекция. Иммунотропные препараты. Вакцины и их виды. Анатоксины. Календарь прививок.

Иммунотерапия- метод лечения, при котором осуществляется воздействие на иммунную систему: подавление иммунного ответа (иммуносупрессия), стимуляция ответа (иммуностимуляция), восстановление иммунодефицитов (иммунокоррекция). В прикладном, более узком смысле иммунотерапия использует специфические методы серотерапии (применение иммунных сывороток, иммуноглобулинов), вакцинотерапии (лечебные вакцины), иммунокоррекции (десенсибилизация и др.).

Иммунопрофилактика - способ предупреждения инфекционных заболеваний путем создания искусственного специфического иммунитета. Выделяют вакцинопрофилактику (создание активного иммунитета за счет вакцин, антигенов) и серопрофилактику (пассивный иммунитет за счет введения в организм специфических антител - иммуноглобулинов).

Иммуномодулирующая терапия.

Способы иммуномодуляции условно можно разделить на методы иммуностимуляции и иммунодепрессии. Иммуностимуляторы. Иммуностимулирующей активностью обладают препараты тимуса и их синтетические

аналоги, левамизол (декарис), цитокины, препараты адамантанового ряда, некоторые соли, природные соединения, полиэлектролиты.

Кстимуляторам Т- лимфоцитов относятся тактивин, тималин, тимоген, тимоптин, вилозен, декарис, диуцифон, нуклеинат натрия, цинка ацетат, спленин, к стимуляторам В- лимфоцитов - лиелопид, продигиозан, пирогенал. Стимуляторами фагоцитоза являются нуклеинат натрия, метилурацил (последний стимулирует также Т- и В-

лимфоциты). К стимуляторам эндогенного интерферона относят дибазол и арбинол. Для заместительной терапии

применяют иммуноглобулин для внутривенного введения, пентаглобулин (препарат IgM).

Иммунодепресанты.

Кпрепаратам с противовоспалительным и иммунодепрессивным действием относятся глюкокортикоидные гормоны.

Большинство иммунодепрессантов является цитостатиками и часто применяются для химиотерапии злокачественных новообразований. Среди них выделяют антиметаболиты, алкилирующие препараты, антибиотики, алкалоиды и ингибиторы ферментов.

Антиметаболиты чаще всего влияют на обмен нуклеиновых кислот. К антогонистам пурина относятся меркаптопурин и азатиоприн (имуран).

Калкилирующим препаратам относят циклофосфамид, хлорбутин. Основной их мишенью являются белки и нуклеиновые кислоты, с которыми они ковалентно связываются. Нарушаются процессы репликации и трансляции, нарушаются процессы митоза клеток.

Антибиотики. Многие антибиотики оказывают влияние на обмен ДНК и РНК. В наибольшей степени это относится к продуктам деятельности актиномицетактиномицинам С и Д , а также продукту жизнедеятельности грибов Trihoderma polysporium - циклоспорину. Актиномицин Д тормозит деление клеток и ДНКзависимый синтез РНК. Актиномицин С является алкилирующим препаратом. Циклоспорин является активным иммунодепресантом, подавляющим клеточные иммунные реакции, в т.ч. реакции трансплантационного иммунитета, ГЗТ, Т- зависимое антителообразование. Механизм его действия связан с подавлением продукции Т- хелперами ИЛ- 2.

Применение иммунодепресантов, особенно цитостатиков, вызывает много осложнений, в том числе угнетение гемопоэза, снижение противоинфекционной и противоопухолевой защиты.

Несмотря на обширный спектр иммуномодуляторов (особенно иммуностимуляторов), подавляющее число из них на практике используется редко. Причинынедостаточная эффективность, побочные эффекты, токсичность, высокая стоимость, недостаточная изученность и др.

Основную роль в специфической профилактике инфекционных заболеваний имеет вакцинопрофилактика.

Вариоляция - ранее применявшийся способ защиты от натуральной оспы с помощью втирания в кожу небольшого количества заразного материала от выздоравливающих от оспы людей известен с незапамятных времен. В России одной из первых этой процедуре подверглась Екатерина II. Однако способ вариоляции был очень опасным.

Вакцинация. Вакцинацией человечество обязано Э.Дженнеру, который в 1796г. показал, что прививка коровьей оспы - вакцинация (vaccinum - с лат. коровий) эффективна для профилактики натуральной оспы. С тех пор препараты, используемые для создания специфического активного иммунитета, называют вакцинами.

44

Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год

Существует ряд типов вакцин - живые, убитые, компонентные и субъединичные, рекомбинантные, синтетические олигопептидные, антиидиотипические и др.

1. Убитые (инактивированные ) вакцины - это вакцинные препараты, не содержащие живых микроорганизмов. Вакцины могут содержать цельные микробы (корпускулы) - вакцины против чумы, гриппа, полиомиелитная вакцина Солка, а также отдельные компоненты (полисахаридная пневмококковая вакцина) или иммунологически активные фракции (вакцина против вируса гепатита В).

Различают вакцины, содержащие антигены одного возбудителя (моновалентные) или нескольких возбудителей (поливалентные).Убитые вакцины как правило менее иммуногенны, чем живые, реактогенны, могут вызывать сенсибилизацию организма.

2.Ослабленные (аттенуированные) вакцины. Эти вакцины имеют некоторые преимущества перед убитыми. Они полностью сохраняют антигенный набор микроорганизма и обеспечивают более длительное состояние специфической невосприимчивости. Живые вакцины применяют для профилактики полиомиелита, туляремии, бруцеллеза, кори, желтой лихорадки, эпидемического паротита. Недостатки - наличие не только нужных (протективных), но и вредных для организма антигенных комплексов ( в том числе перекрестно реагирующих с тканями человека), сенсибилизация организма, большая антигенная нагрузка на иммунную систему и др.

3.Компонентные (субъединичные) вакцины состоят из главных (мажорных) антигенных компонентов, способных обеспечить протективный иммунитет. Ими могут быть :

- компоненты структур клетки ( антигены клеточной стенки, Н - и Vi - антигены, рибосомальные антигены);

- анатоксины - препараты, содержащие модифицированные химическим путем экзотоксины, лишенные токсических свойств, но сохранившие высокую антигенность и иммуногенность. Эти препараты обеспечивают выработку антитоксического иммунитета (антитоксических антител - антитоксинов). Наиболее широко используются дифтерийный и столбнячный анатоксины. АКДС - ассоциированная коклюшнодифтерийностолбнячная вакцина. Полученные химическим путем вакцинные препараты (примеранатоксины, получаемые обработкой экзотоксинов формалином) называют химическими вакцинами;

- конъюгированные вакцины- комплекс малоиммуногенных полисахаридов и высокоиммуногенных анатоксиновнапример, сочетание антигенов Haemophilus influenzae и обеспечивающего иммуногенность вакцины дифтерийного анатоксина;

- субъединичные вакцины. Вакцину против вируса гепатита В готовят из поверхностных белков (субъединиц) вирусных частиц (HBs антиген). В настоящее время эту вакцину получают на рекомбинантной основе- с помощью дрожжевых клеток с плазмидой, кодирующей HBs антиген.

4.Рекомбинантные вакцины. С помощью методов генной инженерии гены, контролирующие синтез наиболее значимых иммуногенных детерминант, встраивают в самореплицирующиеся генетические структуры (плазмиды, вирусы). Если носителем (вектором) является вирус осповакцины, то данная вакцина будет в организме индуцировать иммунитет не только против оспы, но и против того возбудителя, чей ген был встроен в его геном (если ген HBs антигена - против вируса гепатита В).

Если вектором является плазмида, то при размножении рекомбинантного клона микроорганизма (дрожжей, например) нарабатывается необходимый антиген, который и используется в дальнейшем для производства вакцин.

5.Синтетические олигопептидные вакцины. Принципы их конструирования включают синтез пептидных последовательностей, образующих эпитопы, распознаваемые нейтрализующими антителами.

6.Кассетные или экспозиционные вакцины. В качестве носителя используют белковую структуру, на поверхности которой экспонируют (располагают) введенные химическим или генноинженерным путем соответствующие определенные антигенные детерминанты. В качестве носителей при создании искусственных вакцин могут использовать синтетические полимерыполиэлектролиты.

7.Липосомальные вакцины. Они представляют собой комплексы, состоящие из антигенов и липофильных носителей (примерфосфолипиды). Иммуногенные липосомы более эффективно стимулируют выработку антител, пролиферацию Т- лимфоцитов и секрецию ими ИЛ- 2.

8.Антиидиопатические вакцины. Антиидиотипические антитела содержат “внутренний” специфический портрет антигенной детерминанты. Получают моноклональные антиидиотипические антитела, содержащие “внутренний образ” протективного антигена. Для оптимальных результатов (защиты в отношении возбудителя) необходимо иметь набор МКА против различных антигенных детерминант возбудителя.

В настоящее время в нашей стране производится 7 анатоксинов, около 20 противовирусных и более 20 антибактериальных вакцин. Часть из них является ассоциированными - т.е. содержащими антигены различных возбудителей, или одного, но в различных вариантах.

45

Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год

30. Диагностика оппортунических болезней и дисбиозов. Особенности профилактики и лечения оппортунистических болезней.

Наиболее общими проявлениями ОПИ являются:

-субфебрилитет от 1 месяца до нескольких лет. Характер его может быть непрерывным или периодическим, но наиболее длительный после перенесенных гриппа и ОРВИ;

-лимфаденопатия шейно-подчелюстная, подмышечная. При ЦМВИ и герпинфекции она, как правило, слабая, размер лимфоузлов не более 1,0х0,8 см в диаметре; они обычной плотности, подвижные и безболезненные.

При токсоплазмозе лимфоузлы уплотнены, часто визуально различимые,

чувствительные при пальпации. Нередко симулируют заболевания крови (лимфагрануломатоз, гистоцитоз). Очень часто врачи прибегают к биопсии лимфоузлов, но, не найдя бластоматозного роста, успокаиваются и ведут больных с лимфаденитом, не думая о возможности наличия у пациентов токсоплазмоза. Плохо собирается эпиданамнез, в частности, контакт с кошками, особями сельскохозяйственных животных, а также

46

Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год

сырыми продуктами животного происхождения.

При урогенительном хламидиозе и при болезни Рейтера увеличиваются в размерах и становятся болезненными паховые лимфоузлы. К сожалению, при болезни Рейтера врачи не оценивают должным образом клинических признаков: артралгию, уретрит, коньюнктивит. Наличие у мужчины простатита уже является признаком возможного хламидиоза, особенно при наличии указанной триады.

Третьим, опорным признаком ОПИ, является астеновегетативный синдром, который укладывается в разные диапазоны НЦД, энцефалопатии, вегетсосудистой дистонии. При этом «мешающие» симптомы – субфебрилитет, лимфаденопатия, безуспешность лечения намеренно не замечаются. Наиболее ярко неврологическая симптоматика проявляется при токсоплазмозе вплоть до ошибочного диагноза – рассеянный склероз.

Следующим симптомом является поражение дыхательных путей в виде

рецидивирующей ангины, фарингита, ларингита, бронхита, пневмонии. Наиболее часто патология органов дыхания выявляется при герпинфекции, ЦМВИ и пневмоцистозе, лабораторная диагностика которой пока несовершенна.

Следующим симптомом при ОПИ является поражение глаз. За последние годы установился довольно тесный контакт с окулистами. Однако непробиваемой стенойявляется позднее исследование природы заболевания: длительная местная терапия и только потом – направление на диагностику ОПИ вместо первичного обследования и проведения этиотропной терапии параллельно.

Следующим проявлением ОПИ является поражение желудочно-кишечного тракта.

Выявлено, что 90% больных ЦМВИ имеют гастродуоденит (от катарального до эрозивноязвенного). В 1/3 случаев патология ЖКТ является случайной находкой.

Лечение больных ОПИ проводилось в соответствии с рекомендациями.

Строго соблюдался основной принцип – сочетание этиотропной терапии с адекватной иммуномодулирующей исходя из данных иммунограммы, исследование которой рекомендуется больным ежеквартально.

Показания для бактериологической диагностики дисбактериоза кишечника:

Длительно протекающие инфекции и расстройства, при которых не удаётся выделить патогенные энтеробактерии; затяжной период реконвалесценции после перенесённой кишечной инфекции;

Дисфункции ЖКТ на фоне или после проведённой антибиотикотерапии или у лиц, постоянно контактирующих с антимикробными препаратами. Исследования также следует проводить при болезнях злокачественного роста, у страдающих диспептическими расстройствами, лиц, подготавливаемых к операциям на органах брюшной полости, недоношенных или травмированных новорождённых, а также при наличии бактериемии и гнойных процессов, трудно поддающихся лечению (язвенные колиты и энтероколиты, пиелиты, холециститы и др.). •

Посевы изучают на наличие патогенных микроорганизмов и на нарушение соотношения различных видов микробов.

Результаты исследования следует считать объективными при анализе роста изолированных колоний в том случае, если можно изучить морфологию и подсчитать количество колоний на чашку Пётри. После идентификации проводят пересчёт содержания микроорганизмов каждого вида на 1 г исследуемого материала.

При обнаружении патогенной микрофлоры необходимо изучить ее чувствительность к антибактериальным препаратам и бактериофагам.

При определении чувствительности следует отдавать предпочтение антибиотикам узкого спектра для возможно более направленного подавления патогенов. • К оценке результатов следует подходить осторожно, поскольку состав кишечной микрофлоры варьирует.

Необходимо отличать истинный дисбактериоз от дисбактериаяьнъа реакций {сдвиги в составе микрофлоры незначительны, либо кратковременны и не требуют специфической коррекции).

При истинном дисбактериозе нарушения микробного ценоза обычно коррелируют с клиническими проявлениями, и их нормализация достаточно длительна (20-30 сут). При оценке результатов следует указать

47

Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год

наличие или отсутствие патогенной микрофлоры и дать состав присутствующих микроорганизмов. • Повторные исследования при дисбактериозе. Следует отразить положительную или отрицательную динамику изменения в составе микробных сообществ.

Коррекция дисбактериозов. Для коррекции дисбактериозов следует применять эубиотики — взвеси бактерий,

способные восполнить численность недостающих или дефицитных видов. В отечественной практике широко применяют бактерийные препараты в виде высушенных живых культур различных бактерий, например, коли-, лакто- и бифидобактерины (содержащие соответственно Escherichia coli, виды Lactobacillus и Bifidobacterium),

бификол (содержащий виды Bifidobacterium и Escherichia coli), бактисубтил (культура Bacillus subtilis) и др.

ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

1. Особенности микробиологической диагностики кокковых инфекций. Стафилоккоки, Стрептококки, пневмококки, энтерококки, менингококки, гонококки.

Род Staphylococcus.

В состав рода входит более 20 видов, из которых наибольшее значение имеют S.aureus (золотистый стафилококк), S.epidermidis, S.saprophyticus.

Морфология. Грамположительные кокки, для которых характерно взаиморасположение скоплениями в виде гроздей винограда, т.к. они делятся во взаимоперпендикулярных плоскостях. Имеют микрокапсулу, спор не образуют, жгутиков не имеют.

Культуральные свойства. Факультативные анаэробы, хемоорганотрофы. Хорошо растут на простых питательных средах, в том числе на средах с 5- 10% NaCl. Температурный оптимум от +35 до +37оС, рН 6-8 (лучше

48

Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год

слабощелочная реакция среды). На плотных средах образуют непрозрачные круглые (2-4 мм в диаметре) ровные колонии, окрашенные в цвет липохромного пигмента (кремовый, желтый, оранжевый). Кроме S- форм колоний могут образовывать R- формы. На жидких средах дают равномерное помутнение, затем выпадает рыхлый осадок.

Биохимические свойства. Обладают высокой биохимической активностью, образуют различные ферменты, во многом определяющие патогенность. Каталазаположительны, оксидазаотрицательны. Углеводы ферментируют до кислоты без газа, разжижают желатин с образованием воронки, образуют сероводород. По наличию коагулазы их делят на две группы - коагулаза - положительные и коагулаза - отрицательные. Среди патогенных видов коагулаза - положителен лишь S.aureus, остальные - отрицательны.

Антигенная структура очень сложная (более 50 типов антигенов). По специфичности антигены подразделяют на родовые (общие для стафилококков), перекрестнореагирующие (с изоантигенами эритроцитов, кожи и почки человека), видо- и типоспецифические.

Видоспецифическими антигенами являются тейхоевые кислоты, белок А золотистого стафилококка. Антигенными свойствами обладают токсины.

Факторы патогенности. К ним относят микрокапсулу, компоненты клеточной стенки (тейхоевые кислоты, белок А), ферменты и токсины.

1.Факторами адгезии являются высокие гидрофобные свойства поверхностных структур.

2.Компоненты клеточной стенки стимулируют развитие воспалительных реакций, основное значение в них имеют нейтрофилы.

3.Разнообразные ферменты стафилококков играют роль факторов агрессии и защиты. Главным фактором является плазмокоагулаза, свертывающая сыворотку (плазму) крови и образующая тромбиноподобное вещество, обвалакивающее стафилококки и препятствующее действию защитных реакций организма. Кроме нее - фибролизин, ДНКаза, лецитиназа, фосфатаза.

4.Стафилококки синтезируют обширный комплекс экзотоксинов.

Мембраноповреждающие токсины могут повреждать эритроциты (гемолизины), лейкоциты, макрофаги, тромбоциты и др. Выделяют несколько типов, отличающихся по антигенной структуре, спектру лизируемых клеток, скорости действия.

Эксфолиативные токсины оказывают дерматонекротическое действие (пузырчатка новорожденных).

Экзотоксин, вызывающий синдром токсического шока. Высокосорбционные тампоны вызывали тяжелый эндотоксический шок у женщин.

Энтеротоксины, с которыми связаны пищевые интоксикации. Энтеротоксины - термостабильные белки со свойствами суперантигенов. Они вызывают избыточный синтез интерлейкина 2, который и обусловливает интоксикацию. Интоксикации чаще связаны с употреблением инфицированных стафилококками молочных продуктов.

5.Ряд экзотоксинов и других структур стафилококков обладают аллергизирующим действием, обусловливая эффект развития ГЗТ. Наличие перекрестно - реагирующих антигенов способствует развитию аутоиммунных процессов.

6.Факторы, угнетающие фагоцитоз - капсула, белок А, тейхоевые кислоты, пептидогликан, токсины.

Генетика. Для стафилококков характерна высокая изменчивость, связанная с мутациями и рекомбинациями. У них могут быть различные плазмиды. Особенно распространены штаммы с плазмидами устойчивости к различным антибиотикам (прежде всего - к пенициллинам). Выделяют фаготипы и проводят фаготипирование стафилококков. Для типирования используют наборы умеренных фагов.

Особые свойства возбудителя.

1.Способность поражать практически любую ткань и орган.

2.Очень высокая устойчивость среди неспорообразующих бактерий к факторам внешней среды.

3.Постоянное пребывание на кожных покровах и сообщающихся с внешней средой слизистых оболочках.

4.Суперантигенные свойства.

5.Высокая изменчивость и антибиотикорезистентность, что имеет важное значение для эпидемического процесса. Эпидемиологические особенности. Стафилококковые инфекции могут носить характер эндогенной инфекции (повреждение органов и тканей с проникновением возбудителя) или экзогенный характер, обусловленный различными путями заражения - алиментарным (при стафилококковых отравлениях), контактно - бытовым, воздушно - капельным и воздушно - пылевым.

Существенное значение имеет носительство патогенных стафилококков, чаще всего - на слизистой носа и зева, на втором месте - кожа. В условиях медицинских учреждений (родильные дома, хирургические стационары) и в закрытых коллективах особую опасность представляют резидентные (постоянные) носители, у которых наблюдается колонизация слизистых носа и зева и длительная персистенция стафилококков. Длительное носительство в определенной мере связано с дефицитом местного секреторного иммунитета (секреторного IgA в первую очередь) и хроническими очагами воспаления в организме.

49

Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год

Особенности клиники и патогенеза. Только инфекции, вызываемые золотистым стафилококком, включают более 100 нозологических форм. Стафилококковые инфекции можно разделить на локальные и системные (генерализованные). Среди первых - фурункулы, панариции, мастит, гнойные осложнения раневых поверхностей. Среди вторых - сепсис (септицемия - “гнилокровие” с размножением возбудителя в крови, септикопиемия - сепсис с гнойными очагами - метастазами), стафилококковые пневмонии, осложнения после родов и операций, приводящих к синдрому токсического шока, остеомиелиты и др.

Постинфекционный иммунитет при стафилококковых инфекциях можно разделить на клеточный и гуморальный, антибактериальный и антитоксический. В связи с очень разнообразной и изменчивой антигенной структурой перекрестного иммунитета у стафилококков нет. В защите важную роль имеют антитоксины, антибактериальные антитела, антитела против ферментов патогенности, Т- лимфоциты, фагоциты (тканевые макрофаги при локализованных формах).

Лабораторная диагностика. Применяют бактериологические, микроскопические и серологические методы. Основным является бактериологический метод.

Материал для исследования - кровь, гной, слизь из носа и зева, отделяемое ран, мокрота (при пневмонии), испражнения (при колите), подозрительные продукты, рвотные массы и промывные воды желудка, испражнения - при пищевых интоксикациях.

Имеются принципиальные схемы выделения и идентификации стафилококков, в т.ч. с использованием микротестсистем.

В общем виде схема выглядит следующим образом. Проводят бактериоскопию, выявляя грамположительные кокки в виде гроздей винограда (стафилококки). Высевают материал на простые питательные среды. Подозрительные колонии отбируют и пересевают для изучения на дифференциальные среды - на кровяной агар (гемолиз), молочно - солевой и молочно - желточно - солевой агары (за счет NaCl угнетается рост посторонней микрофлоры, использование сред позволяет лучше выявить пигмент и лецитиназу). Выделенную культуру идентифицируют по видовым признакам, определяют наличие золотистого пигмента, плазмокоагулазную активность, сбраживание маннита, гемолиз, чувствительность к антибиотикам, проводят фаготипирование.

Из серологических тестов чаще применяют РПГА и ИФА для выявления антител к видоспецифическим антигенам (тейхоевым кислотам).

Для определения энтеротоксигенности чаще применяют биологический метод, определение энтеротоксина в реакции преципитации в агаре, определение РНКазы (коррелирует с выработкой энтеротоксина).

Из видоспецифических антигенов отдельно следует сказать о белке А золотистого стафилококка, имеющего важное значение в патогенезе и лабораторной диагностике. Уникальным свойством белка А является его способность связывать Fcфрагменты иммуноглобулинов (субклассов 1,2 и 4 IgG). Белок А, неспецифически связывая Fcфрагмент IgG, активирует компоненты комплемента по классическому и альтернативному пути и усиливает активность натуральных киллеров (клеток NK). Активация приводит к развитию различных местных и системных реакций (анафилаксии, феномена Артюса), угнетению опсонофагоцитарных реакций.

Способность белка А взаимодействовать с любыми (не только специфическими к стафилококку) иммуноглобулинами затрудняет серологическую диагностику стафилококковых инфекций, особенно сепсиса. За счет этого механизма (наличия белка А в крови) у этих больных могут быть выявлены ложноположительные серологические тесты на другие инфекции.

Способность стафилококков за счет белка А нагружаться иммуноглобулинами (в т.ч. специфическими антителами к различным возбудителям) используется в реакции коагглютинации. Насаженные на стафилококки (стафилококковый реагент из инактивированных микробных клеток) специфические антитела за счет свободных активных центров при взаимодействии с соответствующим антигеном (суспензией культуры микроорганизма) дают быструю реакцию агглютинации (коагглютинации - поскольку антитела агглютинируют культуру не самостоятельно, а в комплексе со стафилококками, что и обеспечивает быстрое осаждение тяжелых - нагруженных стафилококками комплексов совместно со специфическим искомым агентом).

Белок А широко используют также в ИФА для выявления специфических IgGантител (конъюгаты “белок А - пероксидаза”), стафилококковый реагент - для дифференциации титров IgG- и IgMантител в серологических реакциях по снижению титров IgGантител после обработки проб сыворотки крови стафилококковым реагентом.

Профилактика и лечение - это наиболее сложные вопросы стафилококковых инфекций. Для проведения адекватной антимикробной терапии необходимо определение чувствительности культур к антибиотикам ( прежде всего - к беталактамовым), в тяжелых и затяжных случаях применяют донорский антистафилококковый иммуноглобулин. Определенный эффект может оказать фаготерапия. Для создания иммунитета применяют стафилококковый анатоксин, создающий антитоксический иммунитет. Современные вакцины недостаточно эффективны, поскольку иммунитет при стафилококковых инфекциях типоспецифический (к определенному сероварианту).

Стрептококки. Гонококки, менингококки.

Стрептококки.

50

Материал составлен by zOrg, для экзамена по микробиологии ИвГМА 2015 год

В семейство Streptococcaceae входит семь родов, из которых для человека наибольшее значение имеют стрептококки (род Streptococcus) и энтерококки (род Enterococcus). Наиболее значимые виды - S.pyogenes (стрептококки группы А), S.agalactiae (стрептококки группы В), S.pneumoniae (пневмококк), S.viridans (зеленящие стрептококки, биогруппа mutans), Enterococcus faecalis.

Морфология. Стрептококки (от греч. streptos - цепочка и coccus - зерно) - грамположительные цитохромнегативные бактерии шаровидной или овоидной формы, растущие чаще в виде цепочек, преимущественно неподвижные, не имеют спор. Патогенные виды образуют капсулу (у пневмококка имеет диагностическое значение). Факультативные (большинство) или строгие анаэробы.

Культуральные свойства. Стрептококки плохо растут на простых питательных средах. Обычно используют среды с кровью или сывороткой крови. Чаще применяют сахарный бульон и кровяной агар, содержащий 5% дефибринированной крови. На бульоне рост придонно - пристеночный в виде крошковатого осадка, бульон чаще прозрачен. На плотных средах чаще образуют очень мелкие колонии. Оптимум температуры +37о С, рН - 7,2-7,6. На плотных средах стрептококки группы А образуют колонии трех типов:

-мукоидные (напоминают капельку воды) - характерны для вирулентных штаммов, имеющих капсулу;

-шероховатые - плоские, с неровной поверхностью и фестончатыми краями - характерны для вирулентных штаммов, имеющих М- антигены;

-гладкие - характерны для маловирулентных штаммов.

Предпочитают газовую смесь с 5% СО2. Способны образовывать L- формы.

Для дифференциации стрептококков используют различные признаки: рост при +10о и 45о С, рост на среде с 6,5% NaCl, рост на среде с рН 9,6, рост на среде с 40% желчи, рост в молоке с 0,1% метиленовым синим, рост после прогревания в течение 30 мин. при 60о С. Наиболее распространенный S.pyogenes относится к 1 группе (все признаки отрицательны), энтерококки (3 группа) - все признаки положительны.

Существует ряд классификаций стрептококков. Наиболее проста классификация, основанная на особенностях роста этих микроорганизмов на агаре с кровью барана (по отношению к эритроцитам).

Бета - гемолитические стрептококки при росте на кровяном агаре образуют вокруг колонии четкую зону гемолиза, альфа - гемолитические - частичный гемолиз и позеленение среды (превращение окси- в метгемоглобин), гаммагемолитические - на кровяном агаре гемолиза незаметно. Альфа - гемолитические стрептококки за зеленый цвет среды называют S.viridans (зеленящими).

Антигенная структура. Серологическая классификация имеет практическое значение для дифференциации имеющих сложное антигенное строение стрептококков. В основе классификации - группоспецифические полисахаридные антигены клеточной стенки. Выделяют 20 серогрупп, обозначенных заглавными латинскими буквами. Наибольшее значение имеют стрептококки серогрупп А,В и D.

У стрептококков серогруппы А имеются типоспецифические антигены - белки М, Т и R. По М- антигену гемолитические стрептококки серогруппы А подразделены на серовары (около 100).

Стрептококки имеют перекрестно - реагирующие антигены с антигенами клеток базального слоя эпителия кожи, эпителиальных клеток корковой и медуллярной зон тимуса. В клеточной стенке стрептококков обнаружен также антиген (рецептор II), способный взаимодействовать с Fсфрагментом IgG.

Факторы патогенности стрептококков.

1. Белок М- главный фактор. Определяет адгезивные свойства, угнетает фагоцитоз, определяет типоспецифичность, обладает свойствами суперантигена. Антитела к М- белку обладают протективными свойствами.

2.Капсула - маскирует стрептококки за счет гиалуроновой кислоты, аналогичной гиалуроновой кислоте в тканях хозяина.

3.С5а - пептидаза - расщепляет С5а - компонент комплемента, чем снижает хемоатрактивную активность фагоцитов.

4.Стрептококки вызывают выраженную воспалительную реакцию, в значительной степени обусловленную секрецией более 20 растворимых факторов - ферментов (стрептолизины S и О, гиалуронидаза, ДНКазы, стрептокиназа, протеазы) и эритрогенных токсинов.

Эритрогенин - скарлатинозный токсин, обусловливающий за счет иммунных механизмов образование ярко красной скарлатинозной сыпи. Выделяют три серологических типа этого токсина (А,В и С). Токсин обладает пирогенным, аллергенным, иммуносупрессивным и митогенным действием.

Генетика. Мутации и рекомбинации менее выражены, чем у стафилококков. Способны синтезировать бактериоцины. Фаги для дифференциации не применяют.

Эпидемиологические особенности. Основными источниками являются больные острыми стрептококковыми инфекциями (ангина, пневмония, скарлатина), а также реконвалесценты. Механизм заражения - воздушно - капельный, реже - контактный, очень редко - алиментарный.