5.1 Плазмиды: общая характеристика, способы репликации, типы, значение для биотехнологии
Плазмиды – внехромосомные мобильные генетические структуры бактерий, представляющие собой замкнутые кольца двунитчатой ДНК. По размерам составляют 0,1-5% ДНК хромосомы. Плазмиды способны реплицироваться автономно от кольцевой хромосомы бактерий или в ее составе (рис. 30).
Рис. 30. Автономная репликация плазмид (1); репликация плазмид в составе бактериальной хромосомы (2)
Плазмиды делят на два главных типа:
- конъюгативные;
- неконъюгативные.
Конъюгативные плазмиды переносят собственную ДНК от клетки-донора в клетку-реципиент при конъюгации. Неконъюгативные плазмиды такой способностью не обладают.
Термин «плазмиды» впервые введен американским ученым Дж.Ледербергом (1952 г.) для обозначения полового фактора бактерий. Плазмиды не обязательный генетический материал бактерий, необходимый для проявления ее жизнедеятельности. Они несут гены, не обязательные для клетки-хозяина, и придают бактериям дополнительные свойства, которые в определенных условиях окружающей среды обеспечивают их временные преимущества по сравнению с бесплазмидными бактериями.
У бактерий различных видов обнаружены R-плазмиды, несущие гены, ответственные за множественную устойчивость к лекарственным препаратам – антибиотикам, сульфаниламидам и др.; F-плазмиды, или половой фактор бактерий, определяющий их способность к конъюгации и образованию половых пилей; Ent-плазмиды, способные к синтезу токсинов; плазмиды биодеградации, придающие клеткам способность разрушать различные органические вещества, в т.ч. и токсичные.
Обычно родственные плазмиды не могут сосуществовать в одной бактериальной клетке – несовместимость плазмид. Одна из них всегда элиминируется. Признак несовместимости детерминируется генетически и широко используется в практике для классификации плазмид.
Плазмиды являются удобной моделью для экспериментов по искусственной реконструкции генетического материала, широко используются в генетической инженерии для получения рекомбинантных штаммов.
5.2 Антропогенные факторы и источники загрязнения Классификации экологических факторов По характеру воздействия
Прямо действующие — непосредственно влияющие на организм, главным образом на обмен веществ
Косвенно действующие — влияющие опосредованно через изменение прямо действующих факторов (рельеф, экспозиция, высота над уровнем моря и др.)
По происхождению
Абиотические — факторы неживой природы:
климатические: годовая сумма температур, среднегодовая температура, влажность, давление воздуха
эдафические (эдафогенные): механический состав почвы, воздухопроницаемость почвы, кислотность почвы, химический состав почвы
орографические: рельеф, высота над уровнем моря, крутизна и экспозиция склона
химические: газовый состав воздуха, солевой состав воды, концентрация, кислотность
физические: шум, магнитные поля, теплопроводность и теплоёмкость, радиоактивность, интенсивность солнечного излучения
Биотические — связанные с деятельностью живых организмов:
фитогенные — влияние растений
микогенные — влияние грибов
зоогенные — влияние животных
микробиогенные — влияние микроорганизмов
Антропогенные (антропические):
физические: использование атомной энергии, перемещение в поездах и самолётах, влияние шума и вибрации
химические: использование минеральных удобрений и ядохимикатов, загрязнение оболочек Земли отходами промышленности и транспорта
биологические: продукты питания; организмы, для которых человек может быть средой обитания или источником питания
социальные — связанные с отношениями людей и жизнью в обществе
Антропогенные факторы среды, внесённые в природу человеческой деятельностью изменения, воздействующие на органический мир. Переделывая природу и приспосабливая её к своим потребностям, человек изменяет среду обитания животных и растений, влияя тем самым на их жизнь. Воздействие может быть косвенным и прямым. Косвенное воздействие осуществляется путём изменения ландшафтов — климата, физического состояния и химизма атмосферы и водоёмов, строения поверхности земли, почв, растительности и животного населения. Развитие промышленности не обязательно приводило к обеднению живой природы, но часто способствовало появлению новых форм животных и растений. Развитие транспорта и других средств сообщения способствовало распространению как полезных, так и многих вредных видов растений и животных.
Источники поступления цинка в окружающую среду.
Цинк широко распространен в природе в виде соединений: сульфида, карбоната, оксида и силиката в комбинации со многими минералами, в количестве, составляющем приблизительно 0,02% Земной коры.
Антропогенные источники вносят вклад в загрязнение атмосферного воздуха цинком вдвое больший, чем природные. Из техногенных источников основным загрязнителем окружающей среды цинком является цветная металлургия (около 50% общего выброса), черная металлургия.
Цинк выделяется из печей в виде пыли, дыма, пара. Оксид цинка, или белый цинк образуется при окислении парообразного чистого цинка или при обжиге руды оксида цинка.
Источники формальдегида.
Антропогенные источники включают непосредственные эмиссии при производстве и промышленном использовании и вторичные (окисление углеводородов, выбрасываемых стационарными и мобильными источниками).
Формальдегид поступает в водную среду в результате сброса коммунальных и промышленных сточных вод, а также в процессе вымывания его из атмосферного воздуха. В дождевой воде городов фиксируется присутствие формальдегида. Формальдегид – сильный восстановитель. Он конденсируется с аминами, с аммиаком образует уротропин. В водной среде подвергается биодеградации, которая обусловлена действием бактерий.
Фоновые концентрации составляют несколько мкг/м3, в городском воздухе достигают величин 0,005-0,01 мг/м3. Вблизи промышленных источников – выше. Кратковременные пиковые концентрации в застроенных городских районах (в часы пик или в условиях фотохимического смога) примерно на порядок выше.
Источники поступления фторидов в окружающую среду.
Фториды существуют в окружающей среде, в природе: в воде, в почве, в горных породах и др. Но влияние на их существование в естественном виде на окружающую среду крайне низко, по сравнению с антропогенными источниками.
Антропогенными источниками выбросов фторидов служат металлургическое производство, электросварка, производство удобрений, алюминия, эмалевое производство, отдельные виды получения стекол, обработка хрусталя, получение хладагентов, пластмасс, обогащение урана, нанесение покрытий и т.д.
Источники техногенного загрязнения.
Электротехника, авиационная, химическая, нефтеперерабатывающая промышленность, машиностроение, строительство, оптика, ракетная и атомная техника.
6.1
Метод сокультивирования. Получение трансгенных растений путем агробактериальной трансформации (в растение переносили исследуемый ген с помощью вектора). Так, с помощью генно-инженерных методов получены растения, способные производить ряд биофармацевтических продуктов для лечения различных заболеваний человека, например, эритропоэтин для лечения анемии, инсулин для лечения диабета, также получены трансгенные.
Электропорация — создание пор в бислойной липидной мембране под действием электрического поля. Это явление используется в биотехнологии для внедрения макромолекул (обычно ДНК или РНК) в клетки млекопитающих, бактерий и растений.
Метод микроинъекции Суть метода микроинъекции заключается во введении раствора генных конструкций в мужской пронуклеус зигот. Обычно инъецируют 1-2 пкл раствора ДНК в концентрации, соответствующей 1000 копиям в 1 пкл микроинъекционного раствора.
Трансформация.
Ввести чужеродную ДНК в растения можно различными способами.
Для двудольных растений существует естественный вектор для горизонтального переноса генов: плазмиды агробактерий. Что касается однодольных, то, хотя в последние годы достигнуты определенные успехи в их трансформации агробактериальными векторами, все же подобный путь трансформации встречает существенные затруднения.
Для трансформации устойчивых ("рекальцитрантных") к агробактериям растений разработаны приемы прямого физического переноса ДНК в клетку, многие из которых взяты из практики работы с клетками бактерий или животных. Эти методы достаточно разнообразны, они включают: бомбардировку микрочастицами или баллистический метод; электропорацию; обработку полиэтиленгликолем; перенос ДНК в составе липосом и др.
Наиболее продуктивным и чаще всего используемым является метод бомбардировки микрочастицами. При достаточной скорости эти частицы могут непосредственно проникать в ядро, что сильно повышает эффективность трансформации. Этим же методом можно, впрочем, трансформировать и другие ДНК-содержащие клеточные органеллы - хлоропласты и митохондрии.
В последнее время был разработан и успешно применен также комбинированный метод трансформации, названный агролистическим. При этом чужеродная ДНК вводится в ткани каким-либо физическим методом, например, баллистическим. Вводимая ДНК включает как Т-ДНК вектор с целевым и маркерным геном, так и агробактериальные гены вирулентности, поставленные под эукариотический промотор. Временная экспрессия генов вирулентности в растительной клетке приводит к синтезу белков, которые правильно вырезают Т-ДНК из плазмиды и встраивают ее в хозяйский геном, как и при обычной агробактериальной трансформации.
Доказательства трансформации растений. После проведения тем или иным способом трансформации растительной ткани ее помещают in vitro на специальную среду с фитогормонами, способствующую размножению клеток. Среда обычно содержит селективный агент, в отношении которого трансгенные, но не контрольные клетки приобретают устойчивость. Регенерация чаще всего проходит через стадию каллуса, после чего при правильном подборе сред начинается органогенез (побегообразование). Сформированные побеги переносят на среду укоренения, часто также содержащую селективный агент для более строгого отбора трансгенных особей.
Ti-плазмида содержит Т-ДНК, которая составляет 12-22 тыс. пар оснований и встраивается в ДНК растительной хромосомы. Она кодирует ферменты синтеза фитогормонов и опинов - производных аминокислот, которые используются бактерией как источник углерода, азота и энергии. Кроме Т-ДНК в Ti-плазмиде содержатся vir-область, отвечающая за перенос Т-ДНК в растение, гены утилизации опинов, а также локусы, контролирующие размножение плазмиды в бактериальной клетке и ее перенос при бактериальной конъюгации. Доказательства того, что именно Ti-плазмиды, а не хромосомные гены бактерий ответственны за поддержание трансформированного состояния клеток корончатых галлов, были получены при изучении штаммов Agrobacterium, содержащих мутантные Ti-плазмиды. Агробактерии, лишенные Ti-плазмид, не индуцируют в зараженном растении ни образования корончатых галлов, ни синтеза опинов. Генетические исследования показали, что ДНК Ti-плазмид содержит гены, которые контролируют развитие опухолей, синтез опинов.