УДК
619:579
МЕТОДИКА
ВЫДЕЛЕНИЯ ФАГОВ БАКТЕРИЙ ВИДА
BACILLUS CEREUS И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
В ВЕТЕРИНАРИИ
Калдыркаев
А.И., Феоктистова Н.А., Юдина М.А.,
Арзамаскина Н.А., Уколова Ю.В.,
Лаврова Ю.А.
Ассоциация
практикующих ветеринарных врачей,
Ульяновск
Бактериофаг
- вирус способный инфицировать
бактериальную клетку, репродуцировать
в ней, образуя многочисленное
потомство, и вызывать ее лизис,
сопровождающийся выходом фаговых
частиц в среду обитания бактерий
[2].
Роль
бактериофага как средства терапии
и профилактики некоторых
инфекционных заболеваний в
настоящее время невелика, а
значение для лабораторной
диагностики ряда инфекции этот
биологический объект не только
не утратил, а, наоборот, начал
привлекать к себе все более
пристальное внимание исследователей.
С каждым годом повышается значимость
бактериофагов как высоко
специфического диагностического
средства, позволяющего надежно
дифференцировать возбудителей
бактериальных видов, а порой
проводить более детальную
дифференциацию отдельных типов
и вариантов внутри данного вида.
Возможность фагоидентификации
вытекает из специфичности действия
фагов, которая может быть настолько
выражена, что позволяет
дифференцировать не только
отдельные виды, но и серологически
неотличимые штаммы в пределах
одного вида.
Поэтому
все большее число исследователей
предпочитают обращаться к фаговым
тестам, как единственному средству,
способному дифференцировать
близкородственные штаммы.
Фагодиагностика основана на
специфической способности фагов
взаимодействовать с определенными
видами (идентификация) или типами
(фаготипирование) бактерий, в
результате чего происходит их
лизис. Феномен лизиса является
основой для использования фага
в диагностических целях. Метод
фагодиагностики широко используется
в лабораторной практике для
идентификации различных видов
микроорганизмов.
Благодаря
типовым бактериофагам можно
изучить мониторинг распространения
бактерий, возможность установить
источник и путь передачи
инфекционного заболевания, т.е.
провести его эпидемиологический
анализ. Так в Канаде в промежуток
с 1986 по 1993 было отобрано 146 изолятов
Bacillus cereus причастных к 18 вспышкам
пищевого отравления. Из них 142
штамма было разделено на 17 типов
фагов [5].
Так
же с помощью специфичных фагов
можно выявлять бактерии вида B.
cereus в кормах для домашних животных,
которые являются причиной пищевых
отравлений. Bacillus cereus способны
вызывать диарейный синдром у
животных, птицы и насекомых, по
истечении 6-18ч, первично обусловленный
несколькими видами токсинов и,
впоследствии, размножением данного
микроорганизма в кишечнике.
Bacillus cereus продуцирует: гемолизин
BL (НBL), негемолитический энтеротоксин
(NHE) и энтеротоксин Т (bc-D-ENT). Продукция
этого комплекса токсинов вызывает
цитотоксический эффект и секрецию
жидкости в кишечнике, при постановке
биопробы на мышах наблюдается
некроз кожи в месте введения и
гибель. Один из основных
энтеротоксинов – НBL состоит из
3-х пептидов 1-го связывающего и
двух литических. Детекцию этого
токсина методом ИФА (Tecra visual
immunoassay [VIA]; Bioenterprises Pty. Ltd., Roseville,
New South Wales, Australia) используют в
качестве критерия токсигенности
выделенного штамма. С помощью ПЦР
на ген НBL было установлено, что
от 41 до 49% изолятов Bacillus cereus способны
к его синтезу.
В
исследованиях использовались 4
штамма B.cereus №96, №8035, №2527, №IP5832,
которые были получены из музея
Научно-исследовательского
инновационного центра микробиологии
и биотехнологии из музея кафедры
МВЭ и ВСЭ ФГОУ ВПО «Ульяновская
ГСХА».
Для
выделения бактериофагов за основу
была взята методика Адамса
[1].
Исследуемый
материал (сточные воды, землю,
навоз), помещали в МПБ в пропорции
1:20 (10 г/мл субстрата + 200 мл МПБ),
сюда же добавляли 1-2 мл. суточной
индикаторной культуры (для
ускорения работы и уменьшения
манипуляций возможно смешивание
индикаторных культур, но это не
всегда полезно так как некоторые
штаммы подавляли продуцирование
фага на всех остальных культурах).
Суспензию исследуемого материала
и культуру инкубировали не более
18-24 часов при температуре (37±1)С0
(длительный срок инкубации приводит
к переходу вегетативных форм
бацилл в споровую). Далее суспензию
фага и бактерий очищали от видимых
примесей механическим фильтрованием.
После чего исследуемую суспензию
центрифугировали 30 мин. при 3000
об/мин. до полного ее просветления.
Прогревание в течение 30 мин. при
65±5°С позволяло инактивировать
сопутствующую микрофлору
(экспериментально доказано, что
вегетативные формы B.cereus устойчивы
к этому диапазону температур).
Следующий
этап – обработка хлороформом в
соотношении 3:10 в течение 30-40 минут
(время отстаивания 10
минут).
Обработанную
суспензию фага высевали на чашки
Петри методом агаровых слоев по
Грациа (1936): в 3 мл. 0,7% МПА,
расплавленного и остуженного до
45-50°С добавляли по 0,2 мл суточной
бульонной культуры В.cereus и
исследуемую суспензию фага в
количестве 0,5 мл. Перемешивали и
распределяли по поверхности
агаровой среды в чашках Петри.
Посевы инкубировали в условиях
термостата в течение 6-12 часов при
37°С.
При
наличии негативных колоний фага,
отвивали бактериальной петлей
отдельную колонию и начинали ее
пассировать (повышать литическую
активность). В пробирку с 4,5 мл МПБ
вносили 0,2 мл фаголизата и 0,2 мл
материнской культуры, инкубировали
в условиях термостата в течение
6-12 часов при 37°С, определяя время
пассажа по росту культуры в
контрольной пробирке (в 4,5 мл МПБ
вносили 0, 2 мл суточной аналогичной
культуры). Типичный процесс роста
бульонной культуры B.cereus – это
первичное помутнение держится
18 - 20 часов, после чего формируется
густая серо-белая бактериальная
пленка, которая легко разбивается
и всегда ложится на дно. Одновременно
с образование пленки идет
просветление бульона за счет
распределения бактерий на дне и
поверхности бульона. Сам бульон
становится прозрачным без видимых
помутнений.
Селекцию
бактериофагов и повышение их
литической активности проводили
методом пассирования фага на
индикаторной культуре с периодической
отвивкой типичных негативных
колоний по методике, описанной
И.М. Габриловичем (1992), С.Н. Золотухиным
(1994) [4].
Для
этого, исследуемый бактериофаг
засевали по методу агаровых слоев
по Грациа (1936), используя разведения
10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10,чтобы на питательной
среде сформировались отдельные
негативные колонии. После
6-12-часового культивирования в
термостате одну негативную
колонию, расположенную от других
не менее чем в 10 мм, отвивали
бактериологической петлёй на
мясопептонный бульон, туда же
вносили индикаторную культуру в
количестве 0,2 мл. Одновременно
ставился контроль: мясопептонный
бульон, засеянный индикаторной
культурой в количестве 0,2 мл.
Пробирки культивировали в
термостате при 37 0С в течение 6-12
часов. Полученный фаголизат
прогревали в водяной бане при
65±5°С в течение 30 минут и исследовали
методом агаровых слоев по Грациа,
затем отбирали негативную колонию
идентичную исходной, с которой
вновь проводили такую же операцию.
В
обычных пассажах без отсева
негативных колоний прозрачная
среда в опытной пробирке без
пленки и наличия осадка, при
наличии характерного роста
B.cereus в контроле, свидетельствует
об активной работе бактериофага,
лизирующего материнскую культуру
за определенный промежуток
времени.
Результаты
исследований и их обсуждение. На
данный момент в России используемых
в ветеринарной практике фагов
B.cereus нет.
Целью
наших исследований, а именно этого
опыта, было выделение типовых
фагов B.cereus. В качестве индикаторных
культур использовались только
референс-штаммы B.cereus №96, №8035,
№2527, №IP5832.
В
ходе опытов нами было выделено
из 10 проб кормов и селекционировано
3 штамма бактериофагов на следующие
материнские культуры: B.cereus №96 –
1; B.cereus №8035 – 1; B.cereus №2527 – 1.
В
результате проведенных исследований
было выделено 3 штамма бактериофагов
вида B.cereus. Дальнейшая наша работа
направлена выделение специфических
цереусных бактериофагов и
конструирование биопрепарата,
использование которого позволит
проводить индикацию и идентификацию
бактерий вида B.cereus за 24 часа. Для
работы с бактериофагами достаточно
иметь одного подготовленного
специалиста, комплект фаговых
биопрепаратов, минимум лабораторной
посуды, термостат, водяную баню,
ступку с пестиком, мясопептонный
бульон, мясопептонный агар.
Разработанный диагностикум
позволит быстро и качественно
дифференцировать возбудителя
заболевания и рекомендовать
соответствующее лечение с учетом
устойчивости возбудителя к
назначаемым ветеринарными врачами
антибиотикам.
Определяя
фаготипы бактерий, вызывающих
заболевание, можно не только
распознать подлинный источник
возбудителя инфекции, но и
проследить сложный путь возбудителя
от источника к восприимчивому
организму. По образному выражению
А.С. Кривиского (1962), «нередко фаг,
как настоящий следопыт, помогает
эпидемиологу и врачу-инфекционисту
распознать возбудителя, проследить
за его распространением и
обезвредить источник его
происхождения, предотвращая тем
самым распространение эпидемии,
соответственно и эпизоотии»
[3].
Литература
1.
Адамс М. Бактериофаги. – М., 1961. –
С. 26-121.
2.
Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. –
М.: Медгиз,1961. – С. 6-184.
3.
Кривиский А.С. Вирусы против
микробов – М.,1962. – С.23-29.
4.
Феоктистова Н.А. Выделение и
изучение биологических свойств
бактериофагов рода PROTEUS,
конструирование на их основе
биопрепарата и разработка
параметров практического
применения: Автореф. дис. … канд.
биол. наук. Саратов, 2006. – 21с.
5.
Ahmed.R., Sankar-mistry P., Jackson. S., Ackermann H. W.,
and Kasatiya S.S. Bacillus cereus Phage Typing as an
Epidemiological Tool in Outbreaks of Food Poisoning //
Journal of clinical microbiology, Mar. 1995, p. 636–640.
|