2. Работа с развивающимися куриными эмбрионами

Для вирусологических исследований используют оплодотворенные яйца 7—12-дневного возраста, которые обычно получают из птицеводческих хозяйств. Можно выращивать эмбрионы в обыкновенном термостате, на дно которого ставят лотки с водой для ув­лажнения воздуха. Температура в термостате должна быть 37— 38°С, а влажность воздуха — 60—65%. Отбирают крупные чистые (но немытые) оплодотворенные яйца, предпочтительно от белых кур, хранившиеся не более 10 дней при 5—10°С. Оплодотворенные яйца распознают по наличию зародышевого диска, который при просвечивании с помощью овоскопа имеет вид темного пятнышка. В термостате яйца содержат на специальных деревянных или ме­таллических подставках, имеющих несколько рядов круглых отверс­тий размером 3,5—4 см. В процессе инкубации яйца следует ежедневно выносить из термостата на 20—30 мин для проветривания и периодически просматривать в затемненной комнате над овоско­пом с целью контроля за развитием эмбриона. Овоскоп представляет собой деревянную или металлическую коробку без дна с поверхностью 12X12 см и высотой 10 см. Сверху делают отверстие диаметром 3,5 см для яйца, а в боковой стенке внизу — небольшую выемку для шнура от электрической лампочки, которую по­мещают внутрь.

При работе с вирусами могут быть использованы различные методы заражения куриных эмбрионов, но наибольшее практическое применение получило нанесение вируса на хорион-аллантоисную оболочку, введение в аллантоисную, амниотическую полость .

3. Работа с культурами клеток

Культивирование клеток вне организма требует выполнения ряда условий. Одним из них является строгое соблюдение стериль­ности при работе, так как используемые питательные среды служат питательным субстратом также для бактерий и грибов. Клетки тка­ней обладают весьма высокой чувствительностью к солям тяжелых металлов. Поэтому необходимо придавать исключительное значение качеству различных ингредиентов, входящих в состав солевых растворов и питательных сред, а также способам обработки посуды и резиновых изделий, применяемым при культивировании клеток.

Для выделения вирусов от больных могут быть использованы разные методы культивирования тканей вне организма. Однако в настоящее время наибольшее практическое применение получили однослойные культуры первично трипсинизированных и стабильных линий клеток. Преимуществом однослойных культур клеток является относительная простота методики приготовления клеточного слоя и легкость учета вызываемых вирусами морфологических из­менений в нем.

Однослойные культуры клеток выращивают в стеклянных плоскостенных сосудах — матрацах — вместимостью 1 л, 250 и 100 мл и в обычных бактериологических пробирках, обработанных соответ­ствующим способом .

Трипсинизированные культуры клеток

Сущность метода заключается в разрушении межклеточных связей в тканях протеолитическими ферментами и разобщении кле­ток для выращивания монослоя на поверхности стекла.

Источником получения клеток могут служить ткани и органы эмбрионов, забитых животных и птиц, а также извлеченные у че­ловека при операции. Используются нормальные и злокачественно перерожденные ткани, эпителиальные, фибробластического типа и смешанные. Способность к размножению клеток, извлеченных из организма, тесно связана со степенью дифференциации ткани. Чем меньше дифференцирована ткань, тем более интенсивной способ­ностью пролиферации обладают ее клетки in vitro. Поэтому клетки эмбриональных и опухолевых тканей значительно легче культивиру­ются вне организма, чем нормальные клетки взрослых животных. Наибольшей потенцией роста среди тканей эмбриона обладают клетки соединительной ткани, а от взрослых животных — эпителиальные клетки.

Наиболее широкое применение в вирусологической практике нашли культуры из трипсинизированных эмбриональных клеток че­ловека, кур, коров, овец, свиней, кроликов, морских свинок, белых мышей и почечных клеток взрослых обезьян.

Выбор ткани зависит от чувствительности ее клеток in vitro к тому или иному вирусу. Строгого параллелизма между восприим­чивостью животных in vivo и чувствительностью клеток их тканей in vitro к вирусам не наблюдается.

Получение и обработка тканей перед трипсинизацией. Извлече­ние эмбрионов и анатомирование тканей производят в боксе вблизи газовой горелки в строго асептических условиях. Извлекаемые тка­ни не должны соприкасаться с дезинфицирующими растворами, гу­бительно действующими на клетки.

Эмбриональные ткани человека получают из родильных- домов в виде свежих соскобов полости матки при удалении 8—14-недель-ной беременности у женщин, не больных инфекционными заболе­ваниями. Соскоб собирают в стерильный сосуд, доставляют в лабо­раторию не позднее 3—4 ч после операции и разбирают на эмали­рованном лотке, обеззараженном спиртом и обжиганием. Так как кусочки тканей (кожа, мышцы, легкие, почки) бывают загрязнены, их отмывают в течение 30 мин тремя порциями солевого раствора, содержащего высокую концентрацию антибиотиков (500 ЕД пени­циллина и 200 ЕД стрептомицина на 1 мл среды).

Используют также ткани 5—6-месячных плодов после искусст­венного аборта и амниотическую оболочку, которую получают от рожениц с нормальными родами. Оболочку освобождают от плаценты, хориона и тщательно промывают солевым раствором с высоким содержанием антибиотиков.

Перевиваемыми линиями клеток называют культуры, обладающие способностью к размножению и перевивкам вне организма. В табл. 16 представлен перечень клеток, получивших наибольшую известность и применение.

При пересеве перевиваемых клеток питательную среду отсасы­вают пипеткой Мора и выливают. Клетки монослоя снимают с поверхности стекла при помощи диспергирования химическими веществами, в качестве которых используют 0,02% раствор версена или 0,25% раствор трипсина. Версен дает наилучшие результаты при диспергировании эпителиоподобных клеток, а трипсин — при диспергировании фибробластоподобных клеток.

В матрацы вместимостью 1000, 250 и 100 мл диспергирующий раствор добавляют соответственно по 30, 15 и 10 мл. Культуры клеток, залитые раствором, инкубируют в термостате до отделения клеток от поверхности стекла при легком покачивании сосуда (с раствором вергена — обычно 10 мин, с раствором трипсина — 5 мин). Взвесь клеток разливают в пробирки и осаждают центри­фугированием при 1000 об/мин 5 мин. При диспергировании клеток трипсином осадок отмывают солевым раствором; при использовании версена отмывания не требуется, так как при добавлении питатель­ной среды содержащийся в ней кальций прекращает действие вер­сена. Осажденные центрифугированием клетки ресуспендируют в небольшом количестве питательной среды. Взвесь клеток контролируют на стерильность, после чего подсчитывают в камере Горяева в окрашенном или неокрашенном виде.

Вирусы бактерий (бактериофаги) широко распространены в природе. Наличие фага в среде указывает на присутствие чувствительных к нему микроорганизмов.

Строение бактериофагов.

Типичная частица бактериофага имеет форму головастика и состоит из головки округлой, гексагональной или палочковидной формы диаметром 45—140 нм и хвоста толщиной 10—40 и длиной 100—200 нм. В головке, окруженной белковой оболочкой — капсидом, содержится нуклеиновая кислота. Различают ДНК-содержащие и РНК-содержащие бактериофаги. Хвост представляет собой белковую оболочку — продолжение белковой оболочки головки. Содержимое головки состоит дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) (длина её нити во много раз превышает размер головки и достигает 60—70 мкм, эта нить плотно скручена в головке) или рибонуклеиновой кислоты (РНК) и около 3% белка и некоторых других веществ. Отросток имеет вид полой трубки, окруженной чехлом, содержащим сократительные белки, подобные мышечным. У ряда бактериофагов чехол способен сокращаться, обнажая часть стержня. На конце отростка у многих бактериофагов имеется базальная пластинка с несколькими шиловидными или другие формы выступами. От пластинки отходят тонкие длинные нити, которые способствуют прикреплению фага к бактерии. Оболочки головки и отростка состоят из белков. Общее количество белка в частице фага 50—60% , нуклеиновых кислот — 40—50% .

В оболочку фаговой частицы и отростка входит белок, состоящий из полиаминов: спермин, путресцин, кислоторастворимый пептид.

Другие бактериофаги не имеют отростка; одни из них округлы, другие — нитевидны, размером 8x800 нм.