oct03002
.pdfМ И Н И |
СТ Е РСТ В О О БРА ЗО В А Н И Я РО ССИ Й СК О Й Ф Е Д Е РА Ц И И |
В О |
РО Н Е Ж СК И Й ГО СУ Д А РСТ В Е Н Н Ы Й У Н И В Е РСИ Т Е Т |
ЛА БО РА Т О РН Ы Е РА БО Т Ы И ЗА Д А ЧИ ПО БИ О ХИ М И И
Практическоепособие поспециальностям « Биология» (011600), « Ф арм ация» (040500)
Воронеж
2003
2
У тв ерж дено научно-м етодическим сов етом биолого-почв енного ф акультета, протокол№ 10 от13.11.02
Состав ители: М атасов аЛ.В ., Попов аТ .Н ., Т екунов аН .А .,
Сем ених инаА .В .
Подготов лено накаф едре аналитической и м едицинской биох им ии и
м икробиологии |
биолого-почв енного |
ф акультета |
В оронеж ского |
|
государств енногоунив ерситета. |
|
|
|
|
Реком ендуется для студентов 3 |
курса в ечернего отделения биолого- |
|||
почв енного ф акультета и студентов |
2 |
и 3 курса ф арм ацев тического |
||
ф акультета. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
3 |
|
|
|
|
|
|
|
СО Д Е РЖ А Н И Е |
|
|
|
С О Д ЕР Ж |
А Н |
И |
Е |
|
|
|
3 |
|||||
.................................................................................................... |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
В В Е Д Е Н И Е |
.......................................................................................................... |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
3 |
|
Работа1. Ц в етны ереакции набелки |
.................................................................. |
|
|
|
|
|
|
4 |
||||||||
Работа2. О саж дениебелков ................................................................................ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
5 |
|||||
Работа3. О пределениеизоэлектрической точки белков ................................... |
|
|
|
6 |
||||||||||||
Задачи потем е« А м инокислоты |
и белки» .......................................................... |
|
|
|
|
|
7 |
|||||||||
Работа 4. В лияние тем пературы , |
актив аторов и ингибиторов |
на скорость |
||||||||||||||
ф ерм ентатив ной |
биох им ической |
реакции. |
О пределение специф ичности |
|||||||||||||
ам илазы |
слюны |
..................................................................................................... |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
9 |
|
Работа 5. О пределение константы |
М их аэлиса и м аксим альной |
скорости |
||||||||||||||
ф ерм ентатив ной реакции................................................................................... |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
10 |
||||||
Работа6. О пределениетипаи константы |
ингибиров ания............................... |
|
|
|
12 |
|||||||||||
Работа 7. |
Ф ерм енты |
подж елудочной |
ж елезы . О пределение актив ности |
|||||||||||||
ам илазы |
в сы в ороткекров и............................................................................... |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
13 |
|||||
Работа 8. М етаболизм |
глюкозы |
в |
организм е челов ека и его наруш ения. |
|||||||||||||
О пределение |
концентрации |
глюкозы |
|
в |
сы в оротке |
кров и |
и м оче. |
|||||||||
К ачеств енны ереакции накетонов ы етела........................................................ |
|
|
|
|
|
17 |
||||||||||
Работа 9. |
О бм ен х олестерина в |
организм е челов ека и |
его наруш ения. |
|||||||||||||
О пределениеконцентрации х олестеринав сы в ороткекров и ......................... |
|
|
|
22 |
||||||||||||
Работа |
10. |
М |
етоды |
определения |
и |
классиф икация |
в итам инов . |
|||||||||
К олорим етрический м етод определенияаскорбиновой кислоты в плазм е.... |
26 |
|||||||||||||||
Задачи потем е« В итам ины ».............................................................................. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
28 |
||||||
Работа11. К оличеств енноеопределениепиров иноградной кислоты |
в кров и |
|||||||||||||||
колорим етрическим м етодом |
(поУ м брайту) ................................................... |
|
|
|
|
31 |
||||||||||
Работа 12. |
Биологическое окисление. К оличеств енное определение А Т Ф |
и |
||||||||||||||
креатинф осф атам ы ш ц....................................................................................... |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
32 |
|||||
Задачи потем е« М |
етаболизм » .......................................................................... |
|
|
|
|
|
|
|
|
36 |
||||||
Работа |
13. |
М |
инеральны й |
обм ен |
в |
организм е челов ека. |
О пределение |
|||||||||
концентрации кальцияи х лоридов в сы в ороткекров и.................................... |
|
|
|
39 |
||||||||||||
Работа 14. |
А зотисты й |
обм ен. |
О пределение концентрации |
м очев ины |
в |
|||||||||||
сы в ороткекров и................................................................................................. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
45 |
||||
Работа 15. |
О пределение концентрации креатинина в сы в оротке кров и и в |
|||||||||||||||
м оче. Расчетклиренсакреатинина.................................................................... |
|
|
|
|
|
|
48 |
|||||||||
Работа 16. |
М ех анизм |
действ ия адреналина. О пределение адреналина в |
||||||||||||||
сы в ороткекров и................................................................................................. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
51 |
||||
Заданиепотем е« Перенос генетической инф орм ации» .................................. |
|
|
|
53 |
||||||||||||
ЛИ Т Е РА Т У РА .................................................................................................... |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
54 |
|||
Б и охи м и я |
|
|
|
|
|
В В ЕД ЕН И Е |
|
|
|
|
||||||
(греческоеbios - ж изнь) - это наукао м олекулярны х основ ах |
ж изни. О наизучаетх им ический состав организм ов , прев ращ ениев ещ еств и
4
энергии, котороеосущ еств ляетсяв процессеих ж изнедеятельности. В опросы
и задачи, представ ленны е в данном |
м етодическом |
пособии, |
призв аны |
акцентиров ать в ним ание студента |
на основ ны х |
в опросах |
учебной |
програм м ы , в ы зв атьинтерес к познанию этой ув лекательной области науки. Лабораторны е работы дают в озм ож ность в х оде их в ы полнения осв оить основ ны еприем ы в ы деления и количеств енного определения биом олекули научитьсяоценив атьинф орм атив ностьбиох им ических тестов при некоторы х патологических состояниях
Р абота 1. Ц ветн ы е реакциин а белки
1. Биуретов ая реакция: обуслов лена наличием пептидны х св язей в белках и полипептидах , благодаря которы м в щ елочной средес солям и м еди образуют Си— Nа-ком плексную соль полипептидов и белков сине- ф иолетов ого цв ета. К 1 м лраств орабелкадобав ляют1 м л10%-го раств ора
NaOH и 1-2 капли 1%-го |
раств ора |
CuSO4. Появ ляется |
ф иолетов ое |
окраш ив ание. |
|
|
|
2. К сантопротеинов ая |
реакция |
основ ана на |
способности |
присутств ующ их в м олекуле белка аром атических ам инокислот (тирозина, триптоф ана и ф енилаланина) образов ы в ать с концентриров анной азотной кислотой при подогрев ании ж елтоокраш енны е нитросоединения. К 1 м л раств ора белка прилив ают 0,5 м л концентриров анной HNO3. В ы падает осадок, которы й при подогрев ании частично раств оряется, при этом раств ор приобретаетж елтую окраску. Е сли послеох лаж дения в пробирку добав ить1
м л концентриров анного |
раств ора ам |
м иака, то ж елтое окраш ив ание |
перех одит в оранж ев ое |
в следств ие |
прев ращ ения нитропроизв одны х |
циклических ам инокислотв соли х иноидной структуры . Ф енилаланинлучш е нитруетсяпри добав лении см еси концентриров анны х Н NО 3 и H2SO4.
3. Реакция на триптоф ан. К 1 м л раств ора белка прилив ают 2 м л концентриров анной Н Сl и нагрев ают, не дов одя до кипения, чтобы не улетучился х лористы й в одород. О садок, в ы пав ш ий при добав лении кислоты , при подогрев ании раств оряется, и ж идкость окраш ив ается в ф иолетов ы й цв ет. Э та реакция указы в ает на наличие в яичном белке не только триптоф ана, но и углев одов : триптоф ан реагируетс оксим етилф урф уролом , образующ им ся из м оносах аридов , в результате чего в озникает ф иолетов о- красноесоединение.
5. Реакция с ацетатом св инца. Полож ительная реакция указы в ает на наличие в белков ой м олекуле атом ов серы цистеина и цистина. К 1 м л раств ора белка добав ляют 2 м л1%-го NaOH, перем еш ив ают, кипятят 2-3 м ин., затем прибав ляют 1-2 капли 5%-го (CH3COO)2Pb и продолж ают нагрев ать до в ы падения черного осадка PbS. Реакция идетпо следующ ем у урав нению:
R-SH+2NaOH → Na2S+R-OH+H2O Na2S+(CH3COO)2Pb → РbS+2СН зСО ONa
5 6. Н ингидринов ая реакция указы в аетнаприсутств иев ам инокислотах
α-ам иногрупп. При этом |
происх одитв ы делениеСО 2. К 0,2-0,5 м лраств ора |
||||||||||
ам инокислот |
прибав ляют 2-3 |
капли |
0,1 %-го ацетонов ого |
раств ора |
|||||||
нингидрина, |
кипятят 2 |
м ин. |
Появ ляется |
сине-ф иолетов ое окраш енное |
|||||||
соединение |
|
в следств ие |
в заим одейств ия |
дв ух |
м олекул нингидрина с |
||||||
ам инокислотой. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
Р абота 2. О сажден ие белков |
|
|
|||||
Характерны м |
св ойств ом белков ы х в ещ еств |
яв ляется их |
способность |
||||||||
осаж даться из раств оров |
под |
в оздейств ием |
различны х ф акторов среды . |
||||||||
О саж дение |
белков |
нейтральны м и |
солям и |
(« в ы салив ание»), |
наприм ер |
||||||
(NH4)2SO4, |
NaCL, |
Nа2SO4, наш ло |
ш ирокое прим енение в |
их |
очистке, |
поскольку послеудаления соли белки в осстанав лив аютсв ои биологические ф ункции. При нагрев ании белков , добав лении солей тяж елы х м еталлов , экстрем альны х значениях рН и действ ии других ф акторов белки в ы падаютв осадок в следств ие денатурации. При этом их ков алентная структура не претерпев аетизм енений, но биологическая ф ункция у больш инств а белков утрачив ается. Реакции осаж дения белков используют в биох им ической практикедляудалениябелков ы х в ещ еств и дляопределенияих содерж анияв биологическом м атериале.
1. О саж дениебелков кипячением . В пробирку налив ают1 м лраств ора белкаи нагрев аютдокипения. Происх одитденатурация белка. Болееполное осаж дение белка достигается слабы м подкислением его уксусной кислотой или добав лением других электролитов : в 1 м лраств орабелкадобав ляют1-2
капли 1 %-го раств ора уксусной |
кислоты |
и нагрев ают. В ы падает осадок |
|||||||||
белка. |
Я в ление денатурации |
(потеря |
натив ны х |
св ойств ) |
в ы зы в ается |
||||||
глубоким и наруш ениям и структуры |
белка. |
|
|
|
|
||||||
2. |
О саж дение белков |
солям и |
тяж елы х |
м еталлов . |
Белки при |
||||||
в заим одейств ии с солям и |
тяж елы х м еталлов адсорбируют их , образуя |
||||||||||
нераств орим ы есолеобразны еи ком плексны есоединения. |
|
||||||||||
К |
1 м лраств ора белка прилив ают по каплям 5%-й раств ор CuSO4. |
||||||||||
Появ ляетсяосадок, раств оряющ ийсяв избы ткереактив а. |
|
||||||||||
К |
1 м лбелка прилив ают по каплям |
5%-й раств ор ацетата св инца. |
|||||||||
Появ ляетсяосадок, раств оряющ ийсяв избы ткереактив а. |
|
||||||||||
3. О саж дениебелков реактив ам и наалкалоиды . К группереактив ов на |
|||||||||||
алкалоиды |
принадлеж ит |
таннин, |
пикринов ая |
кислота, |
ж елезисто- |
||||||
синеродистая кислота, раств оры |
йодной |
ртути в |
йодистом |
калии и др. |
|||||||
Способность белков |
осаж даться тем и ж е реактив ам и, что и алкалоиды , |
||||||||||
объ ясняется |
образов анием |
нераств орим ы х |
солеобразны х соединений с |
||||||||
основ ны м и |
азотисты м и |
группам и: |
пиррольны м и, |
индольны м и, |
|||||||
им идазольны м и. В |
этом соединении |
белок |
яв ляется катионом , поэтом у |
||||||||
реакцияпротекаетв кислой среде. |
|
|
|
|
|
|
6
К1 м л слегка подкисленного уксусной кислотой раств ора белка прилив ают3-5 капельнасы щ енногораств орапикринов ой кислоты . В ы падает осадок белка.
К1 м лраств орабелка, подкисленного 1-2 каплям и раств орауксусной кислоты , прилив ают3-5 капельраств оратаннина. В ы падаетосадок белка.
4. О саж дение белка кислотам и. Проба Геллера. Реакция основ ана на дегидратации и денатурации белкапри действ ии крепкой азотной кислоты . К
1-2 м л концентриров анной HNO3 осторож но, |
по стенкам |
(в наклонном |
||
полож ении пробирки) прилив ают пипеткой 0,5-1 |
м л раств ора белка. Н а |
|||
границе |
дв ух соприкасающ их ся ж идкостей |
образуется |
белое кольцо |
|
св ернув ш егосябелка. |
|
|
|
|
К 1 м лраств ора белка добав ляют несколько капель 20%-го раств ора |
||||
сульф осалицилов ой кислоты , перем еш ив ают. В ы падаетосадок белка. |
||||
К |
1 м л раств ора белка прилив ают |
1 |
м л 10%-го раств ора |
|
трих лоруксусной кислоты . В ы падаетосадок белка. |
|
|
||
5. |
О саж дение белков сульф атом ам м ония. |
К 2 м л раств ора белка |
прилив ают2 м лнасы щ енного раств орасульф атаам м ония и перем еш ив ают. В ы падает осадок глобулинов в следств ие дегидратации и нейтрализации заряда белков . Через 5 м ин осадок отделяют центриф угиров анием и к надосадочной ж идкости добав ляютрастерты й в порош ок сульф атам м ония
до полного насы щ ения. В ы падает осадок |
альбум ина. Полноту осаж дения |
белков пров еряют биуретов ой реакцией. |
Д ля того, чтобы пров ерить |
обратим ость реакции осаж дения, к осадку белка прилив ают рав ны й
содерж им ом у пробирки объ ем |
дистиллиров анной в оды |
и перем еш ив ают. |
Раств орение осадка св идетельств ует об обратим ости |
этого процесса и |
|
сох ранении натив ной структуры |
белка. |
|
6. О саж дение белков в ольф рам атом натрия. К 1-2 м лраств ора белка прибав ляют 3-5 капель 5%-го раств ора в ольф рам ата натрия и 3-5 капель 0,4 н. раств орасерной кислоты . В ы падаетосадок белков . Полноту осаж дения белков пров еряютбиуретов ой реакцией.
Р абота 3. О пределен ие изоэлектрической точкибелков
В следств иеналичия способны х к ионизации групп (концев ы х групп -
СО О Н |
и |
-NH2, |
а такж е боков ы х групп дикарбонов ы х |
и диам инокислот) |
||||
м олекулы |
белков обладают электрическим зарядом . |
В |
кислой среде белки |
|||||
им еют |
|
сум м арны й |
полож ительны й |
заряд, в |
щ елочной |
среде – |
||
отрицательны й. |
При |
определенном |
значении |
рН |
среды |
в еличина |
полож ительны х и отрицательны х зарядов станов ится одинаков ой. Значение
рН , при котором |
белок им еетм иним альны й электрический заряд, |
назы в ают |
|||||
изоэлектрической |
точкой |
(И Э Т ). |
В |
этом |
состоянии белки |
наим енее |
|
устойчив ы |
в раств оре и в ы падают в |
осадок, |
им еют наим еньш ее значение |
||||
в язкости, |
раств орим ости, |
степени |
гидратации и электропров одности, не |
||||
передв игаются к |
электрическим |
полюсам . |
К аж ды й белок им еет св ое |
||||
значениеИ Э Т . Сущ еств уетряд способов определенияИ Э Т белков . |
|
7
Реактив ы : 0,2%-й раств ор казеина или 0,5%-й раств ор ж елатина (раств оряют0,2 г казеинаили 0,5 г ж елатинапри подогрев ании в 10 м л1 н.
раств ораацетатанатрияи дов одятв одой до100 м л). |
|
|
|
||||
|
Ход работы . |
В каж дую |
из |
8 пронум еров анны х |
пробирок |
по |
|
ниж еприв еденной |
сх ем е (табл.1) |
в носят соотв етств ующ ие раств оры . В |
|||||
каж дую пробирку добав ляют 0,5 м л 96% этанола. В |
той |
пробирке, |
где |
||||
обнаруж ится м аксим альное |
пом утнение среды |
(в изуально |
или |
неф елом етрически), рН раств орабудетсоотв етств ов атьИ Э Т белка. О тм етьте степеньпом утнениязнакам и « ¾», « +», « ++» или « ++» в таблице.
|
|
|
Приготов лениераств оров с заданны м |
рН |
Т аблица1. |
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|||||||||||
Реагенты , м л |
|
|
|
|
|
Н ом ерапробирок |
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
1 |
|
2 |
3 |
|
4 |
5 |
|
6 |
|
|
7 |
|
8 |
Н 2О |
|
|
8,4 |
|
7,75 |
8,75 |
|
8,5 |
8,0 |
|
7,0 |
|
5,0 |
|
1,0 |
|
0,01 н. СН 3СО О Н |
|
0,6 |
|
1,25 |
- |
|
- |
- |
|
- |
|
|
- |
|
- |
|
0,1 н. СН 3СО О Н |
|
- |
|
- |
0,25 |
|
0,5 |
1,0 |
|
2,0 |
|
4,0 |
|
8,0 |
||
Раств ор белка |
|
1,0 |
|
1,0 |
1,0 |
|
1,0 |
1,0 |
|
1,0 |
|
1,0 |
|
1,0 |
||
pH |
|
|
5,8 |
|
5,6 |
5,3 |
|
5,0 |
4,7 |
|
4,4 |
|
4,1 |
|
3,8 |
|
Степень |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
пом утнения |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Задачипо теме «А мин окислоты ибелки» |
|
|
|
|||||||||||
|
|
|
|
|
В ариан т № 1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
а) |
И зобразите |
полную |
структуру |
следующ их |
|
пептидов |
||||||||||
(ионизиров анны егруппы |
изобразитев протониров анном |
состоянии): 1) Met- |
||||||||||||||
Glu-Gly-His; 2) Phe-Asp-Phe-Thr. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
б) Биологическая оценка белков |
как ком понентов |
пищ и. О снов ны м |
||||||||||||||
критерием |
оценки белков |
в питании яв ляется наличие в |
них |
незам еним ы х |
ам инокислот. Д айтебиологическую оценку следующ им гексапептидам :
1)Glu-Asp-Pro-Ala-Cys-Gly;
2)Glu-Asp-Pro-Ala-Val-Cys;
3)Glu-Val-Pro-Thr-Ala-Gly;
в ) Раств орим ость полипептидов зав исит от степени полярности группы , особенно отчислаионизируем ы х групп: чем больш еионизируем ы х групп, тем в ы ш ераств орим остьполипептида. К акой полипептид из каж дой пары прив еденны х ниж еболеераств орим в данны х услов иях ?
1)(Gly)30 или (Glu)30 при рН 7;
2)(Lys-Ala)20 или (Ile-Met)20 при рН 3,0
г) Почем у подкисш еем олоко св ерты в ается при кипячении? Чтонуж но
сделать, чтобы избеж атьэтого? Почем у несв ерты в аетсясв еж еем олоко?
|
|
|
8 |
|
|
|
|
|
В ариан т № 2 |
|
|
|
|
а) |
И зобразите |
полную |
структуру |
следующ их |
пептидов |
|
(ионизиров анны егруппы |
изобразитев протониров анном состоянии): 1) Met- |
|||||
Leu-Val-Pro; 2) Phe-Ala-Trp-Tyr. |
|
|
|
|
||
б) Биологическая оценка белков как ком понентов |
пищ и. |
О снов ны м |
||||
критерием |
оценки белков |
в питании яв ляется наличие в |
них незам еним ы х |
ам инокислот. Д айтебиологическую оценку следующ им гексапептидам :
1)Glu-Asp-Pro-Ala-Cys-Gly;
2)Glu-Asp-Pro-Ala-Val-Cys;
3)Glu-Val-Pro-Thr-Ala-Gly;
в) Э лектроф орез ам инокислотнабум аге. К аплю раств ора, содерж ащ его
см есь лейцина, аспарагинов ой кислоты , аргинина, |
нанесли на полоску |
бум аги, предв арительно см оченную буф ером с рН 6, |
и к концам полоски |
прилож или электрическоенапряж ение. К акая ам инокислотабудетдв игаться
каноду? К акаяк катоду? К акаяостанетсянастартов ой точкеили в близи нее?
г) Ф ункции белков . При ум еньш ении концентрации общ его белка в кров и у челов ека пов ы ш ается в осприим чив ость к инф екциям , появ ляются
отеки в тканях , наруш ается кислотно-основ ноесостояниеорганизм аи обм ен в ещ еств . О бъ яснитепричину этих яв лений.
|
|
В ариан т № 3 |
|
|
|
|
а) |
И зобразите |
полную |
структуру |
следующ их |
пептидов |
|
(ионизиров анны егруппы |
изобразитев протониров анном |
состоянии): 1) Tyr- |
||||
Cys-Val-Lis; 2) Thr-Asn-Met-Arg. |
|
|
|
|
||
б) Биологическая оценка белков как ком понентов |
пищ и. О снов ны м |
|||||
критерием |
оценки белков |
в питании яв ляется наличие в |
них |
незам еним ы х |
ам инокислот. Д айтебиологическую оценку следующ им гексапептидам : 1) Gln-Cys-Pro-Thr-Ala-Ile;
2) Val-Pro-Lys-Thr-His-Phe;
в ) Пепсин ж елудочного сока (рН 1,5) им еет изоэлектрическую точку И Э Т =1, т.е. нам ногониж е, чем другиебелки. К акиеф ункциональны егруппы долж ны бы тьв пепсинев относительно больш ом числе, чтобы этотф ерм ент м ог им еть такую низкую И Э Т ? К акие ам инокислоты им еют эту группу в св оем состав е? Н апиш итеструктурны еф орм улы этих ам инокислот.
г) При х им ическом способезав ив ки в началев осстанав лив ают, азатем окисляюттиолов ы е(-SH) группы белков , в х одящ их в состав в олос. И сх одя из особенностей пространств енногостроениябелков в олос, объ ясните, какие м огутпроисх одитьизм ененияв структуребелкапри этом ?
|
|
|
В ариан т № 4 |
а) |
Полипептиды назы в ают путем перечисления ам инокислот (от N- |
||
конца к |
C-концу), |
зам еняя в |
случае больш инств а ам инокислот – ин (-ат) |
суф ф иксом – ил. |
Н азв ание |
последней ам инокислоты не изм еняется. |
Н арисуйтеструктуру глициларгинилтреонилцистеинапри рН 7.
9
б) Биологическая оценка белков как ком понентов пищ и. О снов ны м критерием оценки белков в питании яв ляется наличие в них незам еним ы х ам инокислот. Д айтебиологическую оценку следующ им гексапептидам :
1)Glu-Val-Pro-Thr-Ala-Gly;
2)Val-Pro-Lys-Thr-Ala-Phe;
3)Val-Leu-Met-Thr-Trp-Lys.
в ) Раств орим ость полипептидов зав исит от степени полярности группы , особенно отчислаионизируем ы х групп: чем больш еионизируем ы х
групп, тем |
в ы ш е раств орим ость полипептида. К акой полипептид более |
раств орим |
в прив еденны х услов иях ? |
1)(Ala-Asp-Gly)5 или (Asn-Ser-Arg)5 при рН 10,0;
2)(Ala-Asp-Gly)5 или (Asn-Ser-Arg)5 при рН 3,0.
г) И з см еси белков необх одим о в ы делить белок с изоэлектрической
точкой 9,0. О стальны е белки им еют изоэлектрическую точку около 6,0.
Опиш итеспособполученияэтогобелка.
Работа 4. В лиян ие температуры , активаторов иин гибиторов н а скоростьфермен тативн ой биохимической реакции. О пределен ие
специфичн остиамилазы слюн ы .
Влиян ие температуры н а скоростьфермен тативн ой реакции
Втерм олабильности ф ерм ентов м ож ноубедиться наприм ередейств ия
ам илазы слюны . |
Ф ерм ент ам илаза осущ еств ляет гидролиз |
крах м ала через |
|
пром еж уточны е |
продукты |
распада (декстрины ) |
до м альтозы . |
Н ерасщ епленны й крах м алс йодом даетсинееокраш ив ание, адекстрины в зав исим ости отв еличины св оих частиц даютс йодом ф иолетов ую, красно-
бурую, оранж ев ую |
окраску или в ообщ е не окраш ив аются. М альтоза, |
конечны й продукт |
распада крах м ала, не окраш ив ается раств ором йода. |
Т аким образом , по окраскераств орайодам ож носудитьостепени гидролиза
крах м ала. |
|
|
|
Ход |
работы . В центриф уж ную пробирку собирают 1 |
м л слюны |
и |
дов одят дистиллиров анной в одой до 10 м л. Затем берут 4 |
пробирки: |
в |
каж дую пом ещ аютпо 1 м л1 %-го раств оракрах м алаи по 1 м лразв еденной слюны . Пробирки пом ещ аютна15 м инут: перв ую - в терм остат(при 37° С); в торую – в ледяную баню (при 4° С); третью – накипящ ую в одяную баню (при 100° С); четв ертую остав ляют при ком натной тем пературе (+20° С). Через 15 м инутпробирки ох лаж даюти в каж дую пробирку добав ляютпо 2 капли йода. По интенсив ности и цв ету в озникающ его окраш ив ания судято скорости и глубинепротеканияф ерм ентатив ной реакции гидролизакрах м ала
ам илазной |
слюны . |
Д елают в ы в од |
о в лиянии |
тем пературы |
на скорость |
|||
ф ерм ентатив ной биох им ической реакции. |
|
|
|
|
||||
|
С пецифичн остьдействияфермен тов |
|
|
|||||
По |
специф ичности |
действ ия ф ерм енты |
делят на |
дв е |
группы : |
|||
обладающ ие абсолютной |
специф ичностью |
и |
с |
относительной |
||||
специф ичностью. |
О тносительная |
специф ичность |
наблюдается, |
когда |
||||
ф ерм ент |
катализирует реакции |
одного типа с |
более чем |
одним |
10
структуроподобны м субстратом . А бсолютная специф ичность прояв ляется тогда, когда ф ерм ент действ ует лиш ь на единств енное в ещ еств о и катализируетлиш ьопределенноепрев ращ ениеданногов ещ еств а. Н априм ер, ф ерм ент уреаза катализирует гидролиз м очев ины ; сах араз а катализирует прев ращ ение только сах ароз ы . Стереоспециф ичность – ф ерм ент катализирует прев ращ ение только одного из в озм ож ны х стереоизом еров субстрата.
Ход работы . В дв е пробирки налив ают по 1 м л раств ора ам илазы
(разв еденной слюны ) и в перв ую добав ляют 1 м лраств ора крах м ала, а в о
в торую – 1 м лраств орасах ароз ы . Пробы |
в ы держ ив аютв терм остате15 м ин. |
|
при 37ºС. Затем |
с перв ой пробой (субстрат+ крах м ал) проделы в ают дв е |
|
реакции: пробу |
Т ром м ера и реакцию |
с раств ором йода (к 5 каплям |
инкубационной см еси добав ляют1-2 капли раств орайода). Сов торой пробой проделы в аютреакцию Т ром м ера.
Реакция Т ром м ера: в пробирку добав ляют0,5 м лр-расульф атам еди и прибав ляют по каплям (до появ ления осадка) раств ор гидроксида натрия. Д алее пробирку с содерж им ы м нагрев ают и наблюдают за появ лением окраски. Н аличиекирпично-красногоокраш ив анияуказы в аетнаприсутств ие глюкозы . Сах ароз анеим еетсв ободной альдегидной группы , поэтом у недает реакции Т ром м ера. Реакция Т ром м ерам ож етбы тьполож ительной только в том случае, если сах арозарасщ епиться насв ои состав ны ечасти – глюкозу и ф руктоз у.
Д елают в ы в од о специф ичности ам илазы – гидролизует ли ам илаза сах арозу, или толькокрах м ал?
В лиян ие активаторов иин гибиторов н а активн остьамилазы слюн ы
Ход работы 1. В одну пробирку в носят1 м лH2O, в о в торую – 0,8 м л в оды и 0,2 м л1 %-гораств ораNaCl, в третью – 0,8 м лв оды и 0,2 м лраств ора сульф атам еди (II). 2. В каж дую пробирку добав ляютпо 2 м лразв еденной (1:10) слюны , содерж им оепробирки перем еш ив ают, добав ляютпо 0,5 м лрракрах м алаи остав ляютстоятьпри ком натной тем пературе. 3. В это в рем я готов ят три пробирки с в одой (по 1 м лв каж дой), подкраш енной каплей раств орайода, и добав ляютв них по 2-3 капли содерж им ого опы тны х проб. Н аблюдают окраш ив ание в зав исим ости отстепени расщ епления крах м ала
ам илазой. В перв ой |
пробирке появ ляется ф иолетов ая или красно-бурая |
|||
окраска, в о в торой |
пробирке, |
где ионы |
х лора играют роль актив атора, |
|
появ ляется ж елтая окраска, в |
третьей пробирке, где ионы м еди торм озят |
|||
действ ие ам илазы , окраска остаeтся синей. Е сли описанной картины |
не |
|||
наблюдается, тоопы тпов торяютчерез 10 |
м ин. |
|
||
Записы в ают в |
тетрадь полученны е наблюдения. Д елают в ы в оды |
о |
характерев лияниях лориданатрияи сульф атам еди наактив ностьам илазы .
Работа 5. О пределен ие кон стан ты М ихаэлиса имаксимальн ой
скоростифермен тативн ой реакции
При постоянной концентрации ф ерм ентакрив ая зав исим ости скорости катализируем ой им реакции от концентрации субстрата им еет