5. Технологии приготовления временных и постоянных препаратов биологических объектов для проведения световой микроскопии.

1) Временные препараты

Для изучения растительных объектов с помощью светового микроскопа необходимо приготовить микропрепарат. Микропрепараты, не предназначенные для длительного хранения, называются временными. Изучаемый объект помещают на предметное стекло в каплю воды, глицерина, раствора, реактива или красителя и накрывают покровным стеклом. Такие препараты можно хранить в течение нескольких дней, поместив во влажную атмосферу.

2) Постоянные препараты

Постоянные препараты готовятся по специальным методикам, обеспечивающих их хранение в течение десятков лет. К постоянным препаратам относятся мазки, тотальные препараты и срезы. Мазки используются при изучении клеток крови, культур микроорганизмов, изолированных тканевых клеток. Тотальные препараты представляют собой отдельные прозрачные и тонкие объекты Учебные срезы можно сделать вручную, с помощью бритвы. Однако качественные срезы с заданной толщиной 10...22 микрометра обычно изготавливают с помощью специальных приборов – микротомов. Такие срезы часто называют микротомными препаратами. Для получения более тонких срезов (0,01...0,05 мкм, или 10...50 нанометров) используют ультрамикротомы.

Кратко рассмотрим основные этапы приготовления постоянных препаратов.

1.Фиксация материала. Сразу после окончания фиксации производится промывка материала или водой (после водных фиксаторов), или 80%-ным спиртом (после спиртовых фиксаторов). Количество смен промывных жидкостей – не менее 3. Время – до 24 часов.

2.Обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации. Параллельно происходит уплотнение материала. Последовательное перемещение материала через ряд растворов называется проводка. После водных фиксаторов используется 8 смен спирта: 20%, 40%, 80%, две смены по 96%, две смены по 100%. После спиртовых фиксаторов – 4 смены спирта : две смены по 96% и две смены по 100%. В каждой смене материал выдерживается по 1 часу.

3.Просветление. Это пропитывание материала растворителем парафина – ксилолом (бензолом, хлороформом). Образец помещается на 1 час последовательно в каждый из последующих растворов: 3 части спирта + 1 часть ксилола, затем 2 части спирта + 2 части ксилола, затем 1 часть спирта + 3 части ксилола, затем две смены ксилола.

4.Заливка в парафин. Это замещение ксилола парафином. Образец помещают в смесь ксилола и парафина при температуре 55...57 градусов и оставляют в термостате при этой температуре до полного испарения ксилола (от нескольких часов до нескольких суток). Затем при температуре 55...57 градусов производится проводка через парафин I (6...12 часов), парафин II (6...12 часов) и заливка в парафин III. Парафины I, II, III отличаются только чистотой: парафин III – это окончательная среда, которая должна обладать наибольшей чистотой. В итоге получаются парафиновые блоки, в которых заключены образцы материала. Эти блоки можно резать в любом направлении.

5.Окрашивание срезов. Парафиновые срезы наклеивают на чистое предметное стекло. В качестве клея можно использовать смесь белка куриного яйца с глицерином (в соотношении 1 : 2) с добавлением антисептика (тимола или фенола). Обычно производят депарафинирование срезов. Для этого стекла с наклеенными срезами проводят через ксилол, спирты убывающей концентрации (100%, 96%, 80%, 70%) и дистиллированную воду. Время нахождения в каждой среде – 2...3 минуты. Далее окрашивают согласно методикам.

6.Обезвоживание и просветление окрашенных срезов. Выполняется путем проводки через спирты возрастающей концентрации, а затем через ксилол.

7.Заключение в среды (заливка). Для длительного хранения препаратов их необходимо заключить в среду, предохраняющую препарат от окисления воздухом и от поражения грибками. Для заливки используются специальные смолы (канадский бальзам, пихтовый бальзам), которые растворяют в ксилоле до консистенции жидкого меда. Каплю такого раствора наносят на срез и покрывают покровным стеклом.

6. Химический состав клеточного вещества. Микро и макроэлементы.

В составе клетки обнаружено более 80 химических элементов, при этом каких-либо спеуиальных элементов, характерных только для живых организмов, не выявлено. Однако, только в отношении 27 элементов известно, какие функции они выполняют. остальные 53 элемента, вероятно, попадают в организм из внешней среды.

По содержанию элементы, входящие в состав клетки, можно разделить на три группы:

1. Макроэлементы

Они составляют основную массу вещества клетки. На их долю приходится около 99% массы всей клетки. Особенно высока концентрация четырех элементов: кислорода (65-75%), углерода (15-18%), азота (1.5-3%) и водорода (8-10%). К макроэлементам относят также элементы, содержание которых в клетке исчисляется десятыми и сотыми долями процента. Это, например, калий, магний, фосфор, сера, железо, хлор, натрий.

2. Микроэлементы К ним относятся преимущественно атомы металлов, входящие в состав ферментов, гормонов и

других жизненно важных веществ. В организме эти элементы содержатся в очень небольших количествах: от 0,001 до 0,000001%; в числе таких элементов бор, кобальт, медь, молибден, цинк, йод, бром и др.

3. Ультрамикроэлементы

Концентрация их не превышает 0,000001%. К ним относят уран, радий, золото, ртуть, бериллий, цезий и другие редкие элементы. Физиологическая роль большинства этих элементов в организмах растений, животных, грибов и бактерий пока не установлена.