Лабораторна робота № 3 Третій етап виділення чистої культури. Вивчення ферментативної активності бактерій

1.Теоретична частина

У життєдіяльності бактерій ферменти каталізують різноманітні біохімічні реакції, які лежать в основі функцій подиху, харчування, розмноження м/о. Крім того, бактерії виділяють ферменти в зовнішнє середовище для розкладання складних органічних речовин на більш прості компоненти, зручні для засвоєння бактеріальною кліткою. Біохімічна активність мікробів строго специфічна для даного виду. У мікробіологічній практиці для виявлення ферментів досліджувану культуру мікробів засівають на спеціальні діагностичні середовища. Найбільше часто вивчають сахаролітичні і протеолітичні ферменти.

Сахаролітичні ферменти мікробів

Багато бактерій розщеплюють різні вуглеводи з утворенням кислот, альдегідів і газів. Різноманіття ферментативних реакцій у окремих видів бактерій використовується при диференціальній діагностиці досліджуваних культур м/о.

Середовища, використовувані для визначення сахаролітичної активності бактерій, складаються з трьох основних компонентів:

1. Основного субстрату власне живильного середовища

2. Досліджуваного вуглеводу

3. Індикатора, що вказує на чи наявність відсутність продуктів розщеплення даного вуглеводу

Для виявлення сахаролітичних ферментів досліджувану культуру засівають у живильні середовища Гіса («строкатий ряд» Гіса). Короткий «строкатий ряд» Гіса містить 5 пробірок: із глюкозою, лактозою, манітом, мальтозою і сахарозою. Під дією ферментів м/о одні вуглеводи не розщеплюються і, отже, колір живильного середовища не змінюється. М/о іншого виду розщеплюють цукор, з утворенням кислих продуктів реакції, що змінюють колір індикатора і, відповідно, колір живильного середовища

2. Експериментальна частина

Матеріал і обладнання: спиртівки, бактеріологічні петлі, стерильні пробірки із середовищами Гіса, термостат сухоповітряний, культура м/о, етиловий спирт, світловий мікроскоп, предметні стекла, набір барвників для фарбування по Граму

Третій етап виділення чистої культури

• Візуально (за допомогою лупи) вивчити культуральні і тінкториальні властивості культури, що виросла на похилому агарі. Відзначити характер росту виділеної чистої культури. Для чистої культури характерний однорідний ріст.

• Вивчити чисту культуру методом імерсійної мікроскопії. Приготувати мазок-препарат, офарбити по Граму і мікроскопувати. У мазку з чистої культури виявляються морфологічно і тінкторіально однорідні клітки.

Заповнити таблицю

Вид культури

Вид колонії мікроорганізмів

Величина

Обрис

Край

Поверхня

Профіль

Однорідність

Консистенція

Колір

Прозорість

Морфологія фарбування по Граму

Вивчення сахаролітичної ферментативної активності чистої культури

Приготувати пробірки з «строкатим рядом» Гиса (із глюкозою, лактозою, маннітом, мальтозою і сахарозою). Поставити пробірки в штатив в один ряд, на кожній пробірці написати назва цукру, що міститься в середовищі. На першій пробірці вказати назва виду культури.

Посів зробити торканням поверхні середовища бактеріологічною петлею.

Засіяні пробірки закрити пробками, загорнути в папір, підписати і помістити в термостат на 24 години при 37ºС.

0. Аналіз ферментативної активності чистої культури

• Візуально оцінити ферментативну активність, виявлену м/о. Відзначити зміни в пробірках «строкатого ряду» по ряду ознак:

  • Зміна кольору і ступеня прозорості середовища

  • Наявність і ступінь інтенсивності процесів газоутворення, локалізацію пухирців газу на поверхні й у товщі МПА

  • Зміна консистенції живильного середовища

  • Зміна рН середовища

• Замалювати пробірки «строкатого ряду» із указівкою зміни кольору середовища і його прозорості

• Заповнити таблицю

Ряд Гиса Вид м/о

Глюкоза

Лактоза

Манніт

Мальтоза

Сахароза