3.2.3. Приготування гемолітичної системи.

Гемолітичну систему готують змішуванням в рівних об’ємах, 2,5% суміші еритроцитів барана та гемолітичної сироватки (гемолізин у подвоєному титрі).

Наприклад, при титрі гемолізину 1:1000 беруть 2:1000, тобто для приготування 100 см³ гемолізину беруть 0,2 см³ гемолізину з ампули і розводять в 99,8 см³ фізіологічного розчину. Отримані 100 см³ розчину гемолізину змішують з 100 см³ суміші еритроцитів. Гемолітичну систему поміщають на 20 хвилин у водяну баню при температурі 37–38°С для сенсибілізації еритроцитів.

3.2.4. Титрування комплементу.

Перед постановкою головного дослідження проводять титрування комплементу у бактеріолітичній системі з позитивною сапною і негативною сироватками та 1–2 сироватками з досліджуваної партії.

Позитивну, негативну сироватку та сироватку з партії розводять 1:10 фізіологічним розчином (1 см³ сироватки та 9 см³ фізіологічного розчину) та інактивують при температурі 60–62°С протягом 30 хвилин і розливають по 0,2 см³ в два ряди по десять пробірок.

Відбирають необхідну для даного об’єму досліджень кількість ампул (флаконів) з комплементом, розчиняють препарат у фізіологічному розчині, кількість якого вказана на ампулі (флаконі), зливають в одну ємність і перемішують. Таким чином отримують основний розчин комплементу, який зберігають в холодильнику протягом постановки реакції. З цього розчину готують розведення 1: 20 для титрування.

Для розведення комплементу беруть додатковий ряд пробірок, в яких готують попереднє розведення комплементу, але об’єм збільшують в 10 раз. Потім дозатором переносять по 0,2 см³ розведеного комплементу у всі пробірки кожного ряду і вносять інші інгредієнти, як вказано в таблиці 2.

Таблиця 2

Схема титрування комплементу в бактеріолітичній системі

Компоненти реакції	Ряд пробірок у штативі	Номери пробірок
		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Негативна сироватка в розведенні 1:10	перший	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
	другий	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Антиген в робочому титрі	перший	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
	другий	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Фізіологічний розчин	перший	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	другий	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Комплемент у розведенні 1:20	перший	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
	другий	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Водяна баня 20 хв. при 37-38°С
Гемолітична система	перший	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
	другий	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
Водяна баня 20 хв. при 37-38°С
Наприклад	перший	чг	чг	чг	чг	пг	пг	пг	пг	пг	пг
	другий	чг	чг	чг	чг	пг	пг	пг	пг	пг	пг
Додатковий ряд пробірок для попереднього розведення комплементу
Комплемент у розведенні 1:20		0,2	0,4	0,6	0,8	1,0	1,2	1,4	1,6	1,8	2,0
Фізіологічний розчин		1,8	1,6	1,4	1,2	1,0	0,8	0,6	0,4	0,2	-

Примітка: ЧГ- частковий гемоліз; ПГ- повний гемоліз.

 

Титром комплементу в бактеріолітичній системі вважають мінімальну його кількість, яка необхідна для повного гемолізу суспензії еритроцитів в пробірках з негативною та досліджуваними сироватками з антигеном і без антигену, а також в пробірках з позитивною сироваткою без антигену протягом 20 хвилин у водяній бані при 37–38°С та затримку гемолізу в пробірках з сапною сироваткою і антигеном.

3.2.5. Приготування комплементу.

 

Кількість комплементу для головного досліду визначають за формулою:

ТхП

Х= ------,

20

 

де Х - кількість комплементу, необхідна для головного досліду;

Т - титр комплементу в бактеріологічній системі;

П - кількість пробірок в реакції;

20 - розведення комплементу (1:20).

 

Наприклад, в досліді 200 пробірок, титр комплементу (згідно табл.2) – 0,1.

 

Тобто, кількість його для проведення досліду:

 

0,1х200

----------- = 1,0 см³

20

 

Необхідна кількість розведеного комплементу для головного досліду дорівнює 40 см³ (0,2 см³х200). Тобто до 1,0 см³ основного розчину комплементу добавляють 39,0 см³ фізіологічного розчину.

3.3. Проведення головного дослідження.

Сироватки досліджують у розведенні 1:5, 1:10 з антигеном та 1:5 без антигену (визначення антикомплементарності сироватки). При масових дослідженнях допускається постановка реакції в одній пробірці з розведенням сироватки 1:10 з антигеном.

Для дослідження проб в одній пробірці дозатором беруть 0,02 см³ сироватки і 0,18 см³ фізіологічного розчину.

Для дослідження проб у трьох пробірках в першу наливають 0,1см³ досліджуваної сироватки і додають 0,4 см³ фізіологічного розчину (розведення 1:5). З першої пробірки переносять у другу 0,2 см³ і 0,1 см³ у третю, в яку потім додають 0,1 см³ фізіологічного розчину. Інактивацію сироваток проводять як зазначено у п. 3.2.4.

  

 

 

Таблиця 3

Головне дослідження

Компоненти реакції	Перше масове дослідження			Повторне дослідження				Контроль гемолітичної системи
	Пробірки з досліджуваними сироватками	Контроль гемолітичної системи	Пробірки для кожної досліджуваної сироватки
			1		2	3
Досліджувані сироватки	0,04	-	0,04,		0,04	0,02
Фізіологічний розчин	0,06	0,6	0,36		0,16	0,18	0,6
Інактивація сироваток
Антиген у робочому титрі	0,2	-	-		0,2	0,2	-
Комплемент у робочому титрі	0,2	-	0,2		0,2	0,2	-
Водяна баня 37 -38°С- 20 хв.
Гемолітична система	0,4	0,4	0,4		0,4	0,4	0,4
Водяна баня 37 -38°С – 20 хв.

 

При постановці головного дослідження одночасно ставлять такі контролі:

—      позитивна сапна і негативна сироватки в тих же розведеннях, що і досліджувані з антигеном і без антигену ;

—      антиген без сироватки (на антикомплементарність);

—      антиген без сироватки і комплемента (на гематоксичність);

—      гемолітична система з фізіологічним розчином.

Якщо досліджувані сироватки в одній пробірці ( розведення 1:10 з антигеном) дали затримку гемолізу, їх досліджують повторно у трьох пробірках.