Частная_ISBN-NEW

ют соскоб со слизистой и с помощью шлифовального стекла делают мазок. Пре- параты-отпечатки готовят из печени, почек, желчного пузыря, желудка, легких и мозга. В дальнейшем препараты из материала, присланного для вирусологического исследования, исследуют в РИФ, а для гистологического – на обнаружение специфических телец-включений.

Первичное обнаружение вируса при чуме плотоядных имеет большое значение, так как успешное выделение вируса из патматериала не всегда удается. Вирус обнаруживают в патматериале по результатам РИФ и гистологического исследования. В РИФ можно исследовать препараты, полученные как после смерти животного, так и при жизни (из конъюнктивы и носовых ходов). Положительный результат характеризуется специфическим свечением пораженных клеток.

Гистологический метод менее чувствителен, чем серологический для первичного обнаружения вируса в патматериале, поэтому рекомендуют их сочетанное использование при постановке диагноза. С этой целью приготовленные мазки, отпечатки или гистосрезы окрашивают смесью красок метиленового синего и фуксина в течение 1 мин и исследуют под микроскопом. Ядра эпителиальных клеток окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, цитоплазма – в светлосиреневый цвет, а вирусные тельца – в ярко-красный или малиновый. При этом включения располагаются в цитоплазме клеток или внутри их; округлой, овальной или полиморфной формы, имеют четкие края, количество их колеблется от единичных до десяти и более в одной клетке.

Выделение вируса проводят на развивающихся куриных эмбрионах или культурах клеток. В первых пассажах вирус вызывает лишь слабое помутнение ХАО и гибель эмбрионов в 5-10% случаев. О предполагаемом присутствии вируса судят при постановке РГА с эритроцитами цыпленка.

Из культур клеток для выделения вируса чаще используют клетки почек хорька и альвеолярных макрофагов. ЦПД характеризуется формированием круглых многоядерных гигантских клеток, на месте которых в последующем образуется синцитий неправильной формы. Возможно также проводить культивирование уже зараженных клеток почек, полученных от больных исследуемых собак.

Идентификацию изолированного вируса проводят с помощью серологи-

ческих реакций, использование которых зависит от способа изоляции возбудителя. В случае выделения вируса на РКЭ используют РТГА с 1%-ной взвесью куриных эритроцитов, при этом гемагглютинирующий титр может достигать высоких значений (1:2560 и выше).

В случае выделения культурального вируса используют РН на культурах клеток. Для этого к зараженной культуре добавляют питательную среду 5% специфической сыворотки сразу же после контакта вируса с клеточным монослоем. По подавлению ЦПД вируса судят о специфичности поражения клеточного монослоя.

Парвовирусный энтерит плотоядных - контагиозная вирусная бо-

лезнь щенков моложе 5-месячного возраста, проявляющаяся рвотой, геморрагическим гастроэнтеритом, миокардитом, лейкопенией, дегидратацией и гибелью.

58

ние антигены вирусов гриппа всех родов выявляют в РСК, поэтому данная серологическая реакция используется в лабораторной практике определения родовой принадлежности изолированного вируса.

Наружными антигенами являются белки двух типов: гемагглютинин (Н) и нейраминидаза (N). Субъединица Н вызывает гемагглютинацию эритроцитов различных видов животных. При температуре 4-22ºС вирусы гриппа способны гемагглютинировать эритроциты более 22 видов животных, но в практике чаще используют человека (группа О), кур, морских свинок. Нейраминидаза придает вирусу способность проникать через слизистые оболочки верхних дыхательных путей. Антигены Н и N являются неоднородными в пределах рода А. До настоящего времени установлено наличие 15 вариантов гемагглютинина (1-15) и 9 вариантов нейраминидазы (1-9), что дает возможность разделять вирусы гриппа на серологические разновидности (сероварианты). Различное сочетание разных типов Н и N позволило идентифицировать более 50 сероваров вируса гриппа А. При этом основная их масса обнаружена у птиц.

Патматериал для исследования получают путем протирания носовых ходов стерильными ватными тампонами, которые сразу же после извлечения погружают в пробирки с раствором Хенкса. Кроме того, материал можно получать введением в каждый носовой ход 10 мл физиологического раствора и извлечением смывной жидкости в пробирки. Носовые смывы берут от 3-4 больных животных с явными клиническими признаками в первые 5-6 дней болезни. От павших животных отбирают кусочки легких и трахеи размером до 5 см в диаметре и отправляют в охлажденном или замороженном виде.

Подготовка патматериала. В лаборатории полученный жидкий материал (смывы со слизистых) оттаивают при комнатной температуре, тампоны отмывают в растворе Хенкса. Полученную жидкость центрифугируют при 1000-2000 тыс об/мин для осаждения крупнодисперсных частиц, добавляют антибиотики по общей методике, оставляют для контакта в холодильнике или при комнатной температуре на 1-2 часа. Подготовленный таким образом материал используют для заражения развивающихся куриных эмбрионов.

Лабораторная диагностика гриппа проводится по двум направлениям:

-выделение вируса на чувствительных тест-объектах с последующей его индикацией и идентификацией;

-выявление специфических антител в крови у переболевших жи-

вотных (ретроспективная диагностика).

Первое направление исследования используется при первичной постановке диагноза на болезнь в благополучных хозяйствах, второе – для выяснения эпизоотической обстановки по заболеванию (наличие циркуляции вируса среди животных хозяйства).

Выделение вируса гриппа проводят на развивающихся куриных эмбрионах. Заражение проводят в аллантоисную или амниотическую полость 9-12 суточных эмбрионов, которых затем инкубируют в течение 48-72 часов, иногда 96 часов при 37ºС. Введение исследуемого материала в амниотическую полость является более чувствительным способом. В обоих случаях заражения вирулентным вирусом гриппа А при вскрытии на теле эмбрионов обнаружива-

11

ют геморрагии. Присутствие вируса гриппа А подтверждают постановкой РГА с экстраэмбриональными жидкостями.

Идентификацию вируса гриппа проводят в РТГА с использованием штаммоспецифических сывороток против вируса гриппа рода А. По результатам реакции определяют присутствие вируса гриппа А в материале. Положительным результатом лабораторного исследования является выделение вируса гриппа из патматериала с последующей его идентификацией в РТГА.

Серологическая диагностика заключается в выявлении специфических антител в крови переболевших животных с целью определения благополучия поголовья по гриппу. Для этого отбирают кровь от 10-20 животных от каждой группы. Интервал между пробами должен составлять не менее 8-14 дней. Сыворотки перед исследованием обязательно прогревают при 60ºС в течение 30-ти минут, обрабатывают углекислым газом (СО2) для удаления термостабильных ингибиторов и добавляют эритроциты кур для удаления неспецифических агглютининов. Наличие антител устанавливают в РТГА с использованием эталонных штаммов вируса гриппа А. Выявление 4-кратного и более нарастания титра антител в парных пробах сыворотки крови свидетельствует о переболевании животного гриппом.

Инфекционный ринотрахеит - остро протекающая контагиозная болезнь крупного рогатого скота, характеризующаяся преимущественно ката- рально-некротическими поражениями дыхательного тракта, лихорадкой, общим угнетением и конъюнктивитом, а также развитием пустулезного вульвовагинита при попадании вируса в половые органы животного и абортами.

Возбудителем инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота является вирус из семейства Herpesviridae, подсемейства Alphaherpesvirinae, рода Varicellavirus. Это ДНК-геномный вирус, в капсид которого входит 33 структурных белка, многие из которых участвуют в качестве антигена в иммунологических реакциях. Наибольшей иммуногенностью обладают два белка, обозначаемых как VP74 и VP90, последний из которых, кроме того, функционально является гемагглютинином и способен агглютинировать эритроциты белых мышей. Вследствие изменчивости белков вирус ИРТ дифференцируют на подтипы 1.1., 1.2а, 1.2b и 5, последний из которых обладает значительным нейротропизмом. Однако в большинстве случаев клиническая патология обусловлена подтипом 1.1.

Вирусы ИРТ, как и все герпесвирусы, реплицируются в ядре, образуют там внутриядерные включения, что является характерной особенностью всех герпесвирусов. Вирус болезни так же, как и все герпесвирусы, обладает способностью длительно персистировать внутри организма. Вирус в период латентной инфекции сохраняется в нейронах сенсорных ганглиев спинномозговых нервов, причем ее длительность может достигать 19 месяцев. Аналогичное явление наблюдают при введении вакцинных ослабленных (аттенуированных) штаммов возбудителя. Активизация вируса и переход болезни в острую форму происходят при снижении резистентности организма, а также при применении некоторых лекарственных веществ, в частности кортикостероидов.

12

Болезнь проявляется несколькими клиническими признаками, поэтому выделяют ее несколько форм. При легочной форме отмечают развитие пневмоний. Кишечная форма характеризуется рвотой, запорами или поносами с примесью крови. Кожная форма сопровождается появлением на бесшерстных участках пустулезной сыпи, наполненной зеленоватым содержимым. Нервная форма проявляется сильным возбуждением животного, судорогами и параличами конечностей. При всех формах болезни отмечают поражение глаз в виде конъюнктивита, светобоязни, опухания век и кератита.

Возбудителем чумы плотоядных является вирус из семейства

Paramyxoviridae, подсемейства Paramyxovirinae, рода Morbillivirus. Кроме ука-

занного возбудителя данный род также включает возбудителей кори человека, чумы крупного рогатого скота, между которыми и вирусом чумы плотоядных установлено антигенное, а в случае с вирусом кори человека – и иммунобиологическое родство. Возбудитель вызывает заболевание у млекопитающих главным образом семейства волчьих – чума кошек не родственна чуме плотоядных. Человек и приматы к вирусу не восприимчивы.

В антигенном отношении возбудитель однороден, однако в одних случаях специфические антитела нейтрализуют вирус в высоких концентрациях, а

вдругих способны нейтрализовать только низкие концентрации антигена. В этой связи первые штаммы условно называются классическими, а вторые – вариантными, хотя иммунобиологических различий между ними нет.

При попадании в организм вирус проходит первичную репликацию в лейкоцитах миндалин, лимфоузлов и крови. Эта стадия на уровне организма характеризуется инкубационным и продромальным периодами и длится обычно

втечение первых 6 дней. Выделение вируса из патматериала на этой стадии крайне затруднено. С 6-9-го дня начинается репликация вируса в эпителиальных клетках различных органов и тканей, а также глиальных клетках центральной нервной системы. Обычно в это время проявляются симптомы болезни – диарея, конъюнктивит и конвульсии.

Лабораторная диагностика. Многообразие симптомов болезни обычно затрудняет своевременную постановку диагноза, поэтому решающее значение имеет лабораторная диагностика. Изоляция вируса из патматериала затруднена, поэтому часто диагноз ставят на основании результатов первичного обнаружения вируса в патматериале.

Отбор патматериала. При жизни животного отбирают пробы крови в первые 6 дней болезни, когда вирус реплицируется в лейкоцитах, а также мазки из носа и конъюнктивы для гистологического и серологического исследований. От трупов берут кусочки легких, трахеи, селезенки, почек, головного мозга и обязательно мочевой пузырь. При этом отбирают материал как для вирусологического, так и для гистологического исследования. Во втором случае пробы консервируют в 10%-ном нейтральном формалине.

Подготовка материала заключается в приготовлении мазков, препара- тов-отпечатков и приготовлении суспензии для выделения вируса.

Мазки готовят из слизистой оболочки мочевого пузыря. Для этого на предметном стекле в капле физиологического раствора равномерно распреде-

57

пензии из хорион-аллантоисных оболочек зараженных куриных эмбрионов (через 48 часов после заражения). В качестве антитела используют специфическую сыворотку к вирусу инфекционного бронхита кур (желательно использование набора диагностических гипериммунных сывороток против инфекционного бронхита кур, инфекционного ларинготрахеита, ньюкаслской болезни, оспы птиц, что дает возможность дифференцировать эти заболевания птиц).

Для более подробной идентификации вируса инфекционного бронхита кур с целью определения серотипа изолированного штамма проводят постановку РН на куриных эмбрионах. С этой целью используют специфические сыворотки к трем серотипам вируса инфекционного бронхита кур: Массачусетс, Коннектикут, Айова-97. В реакции используют десятикратные разведения идентифицируемого вируса (от 10-1 до 10-6), к которым добавляют равный объем (по 0,5 мл) специфической сыворотки трех типов. После экспозиции 1- 2 часа при 4ºС смесь инокулируют в аллантоисную полость куриным эмбрионам по 0,2 мл, при этом смесью с каждым типом сыворотки заражают по 4 эмбриона. Наблюдение за тест-объектами проводят в течение 8 суток. Реакция нейтрализации считается положительной при отсутствии гибели эмбрионов и патологоанатомических изменений в них при вскрытии. Результат оценивают по индексу нейтрализации: при индексе 1 lg реакцию считают отрицательной, от 1 до 2lg – сомнительной, выше 2lg - положительной. Отрицательный результат РН может свидетельствовать о присутствии в изоляте гетерологического типа вируса инфекционного бронхита кур, не относящегося ни к одному из трех вышеуказанных серотипов.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика основана на выяв-

лении антител в крови птицы или желтках яиц от больной птицы. Однако серологические данные не позволяют судить о резистентности популяции птиц, так как не всегда уровень антител коррелирует с его уровнем и установить с высокой надежностью серотип вируса в связи с большим числом перекрестных серологических в сыворотках крови цыплят более старшего возраста.

Для исследования берут по 5 мл крови не менее чем от 5-10 больных птиц на 14-й и 28-й дни болезни. Уровень антител определяют в РН, РИД, РТГА и ИФА. Перед постановкой реакции нейтрализации все исследуемые сыворотки прогревают при 58ºС в течение 30 минут, добавляют пенициллин и стрептомицин по 100-1000 ЕД/мл. В реакции нейтрализации в качестве антигена используют штаммы Боддетт и Массачусетс, которые способны вызывать гибель эмбрионов через 24-48 часов.

ЛЕКЦИЯ 8. ВИРУСЫ ЧУМЫ ПЛОТОЯДНЫХ, ПАРВОВИРУСНОГО ЭНТЕРИТА ПЛОТОЯДНЫХ, АЛЕУТСКОЙ БОЛЕЗНИ НОРОК

Чума плотоядных (болезнь Карре) – остро протекающая болезнь собак, волков, лисиц, шакалов, норок, соболей, енотов и других плотоядных, характеризующаяся лихорадкой, острым катаральным воспалением слизистых оболочек, пневмониями, кожной экзантемой и поражениями нервной системы.

56

Отбор и подготовка материала. В лабораторию направляют патматериал, взятый в первые 2-3 дня болезни при выраженной клинической картине или от животных, убитых с диагностической целью в острой стадии болезни. От больных животных берут 15-20 проб: смывы с пораженных слизистых оболочек, сперму. После этого тампоны с материалом помещают в стерильные пенициллиновые флаконы или пробирки с 2-3 мл стерильного физиологического раствора или раствора Хенкса, содержащего от 500 до 1000 ЕД / мл антибиотиков. От убитых животных берут кусочки легких с бронхом, селезенки, регионарные лимфоузлы, пораженные участки слизистой ротовой и носовой полостей, миндалины, от абортированных плодов – кусочки паренхиматозных органов. Кусочки материала массой до 20 г помещают в стерильную посуду.

Лабораторную диагностику инфекционного ринотрахеита можно проводить по двум направлениям:

-первичное обнаружение вируса в патматериале в РИФ, ИФА с подтверждением диагноза путем выделения вируса и его идентификацией;

-обнаружение специфических антител в крови больных животных

вРНГА, РН или ИФА (ретроспективная диагностика).

Обнаружение вируса в патматериале проводят вирусоскопическим

методом, основанным на обнаружении вирусного антигена в мазках, отпечатках или гистосрезах из доставленного материала методом иммунофлуоресценции. Для этого из патологического материала от убитого животного готовят препараты-отпечатки или гистосрезы на 4 обезжиренных стеклах по 3 мазка на стекле (всего 12 отпечатков). Со слизистых оболочек и конъюнктивы делают мазки. После фиксации препаратов в охлажденном ацетоне (минус 10-20ºС) в течение 20-30 минут его обрабатывают флуоресцирующими сыворотками и микроскопируют. При этом обращают внимание на свечение вирусного антигена в цитоплазме и перинуклеарной зоне неповрежденных клеток. Ярко-зеленая флуоресценция в виде гранул или диффузного свечения цитоплазмы не менее чем в 10% клеток позволяет оценить препарат как положительный. Предварительный диагноз на ИРТ ставят при наличии не менее 30% положительных препаратов от общего количества исследованных проб.

Первичное обнаружение вируса в патматериале можно также проводить иммунопероксидазным методом ИФА. С этой целью исследуют прижизненно взятые назофарингиальные мазки-отпечатки.

Выделение вируса инфекционного ринотрахеита осуществляют в монослое клеток почек телят (ПТ) и эмбрионов коровы (ПЭК). Цитопатогенное действие вируса ИРТ в культуре клеток характеризуется образованием окон в монослое, округлением клеток, скоплением их в виде «гроздьев» с последующим отслоением их от поверхности стекла.

Идентификацию вируса осуществляют в РН. Реакцию нейтрализации проводят общепринятым методом в первичной культуре ПЭК или перевиваемой линии клеток МДВК. При положительных результатах РН вирус счита-

13

ют полностью идентифицированным.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика основана на вы-

явлении специфических антител ИРТ в крови больных и переболевших животных в РНГА или РН. Для постановки ретроспективного диагноза используют парные пробы сывороток крови, взятых в интервале 3 недель. Результат серодиагностики учитывают по возрастанию титра антител в парных пробах сывороток крови, а также числа серопозитивных животных через указанный интервал. Перед исследованием все пробы сывороток прогревают в водяной бане при 56ºС в течение 30 минут.

РНГА проводят с использованием промышленно выпускаемого эритроцитарного диагностикума. Результаты РНГА оценивают по титрам антител: положительные – 1:16 и выше, сомнительные – 1:8, отрицательные – 1:4, 1:2 и нулевые. Увеличение титра антител в парных пробах в 2-4 раза свидетельствует о наличии инфекции.

Парагрипп-3 крупного рогатого скота – остро протекающая конта-

гиозная болезнь, главным образом, телят, характеризующаяся поражением органов дыхания различной тяжести - от легких ринитов и бронхитов до тяжелой бронхопневмонии. У взрослых животных наблюдают бессимптомную латентную инфекцию без признаков поражения дыхательной системы. У стельных коров инфекция может привести к внутриутробному заражению плода, абортам или мертворождениям.

Возбудителем парагрипа-3 (ПГ-3) крупного рогатого скота является вирус семейства Paramyxoviridae, рода Paramyxovirus. Кроме этого возбудителя род также включает возбудителей паротита человека, парагриппа человека, обезьян, грызунов, а также ньюкаслской болезни.

Геном возбудителя представлен минус-нитью РНК. На поверхности вириона присутствует гликопротеин, обладающий одновременно гемагглютинирующей и нейраминидазной активностью (NH).

Внутренний белковый компонент вириона – рибонуклеопротеид – обладает антигенной активностью и способен выявляться в РСК. Однако РСК в ветеринарии не нашло широкого применения из-за сложности выделения из вириона внутреннего антигена. Поверхностный структурный белок гемагглю- тинин-нейраминидазный гликопротеин, являясь антигеном, выявляется в РТГА. Все штаммы вируса ПГ-3 в антигенном отношении являются однородными, поэтому антигенной вариабельности среди вирусов ПГ-3 не выявлено.

Лабораторную диагностику ПГ-3 всегда проводят параллельно с исследованием материала на аденовирусную инфекцию, респираторносинцитиальную инфекцию, инфекционный ринотрахеит и вирусную диарею из-за сходства их клинических признаков (группа заболеваний, называемых пневмоэнтеритами).

Отбор патматериала. В лабораторию направляют материал от больных животных, взятый в течение первых 2-3 дней болезни при выраженной клинической картине или от животных, убитых с диагностической целью в острой стадии болезни.

От больных берут 15-20 проб следующего материала:

14

после центрифугирования смывов со слизистой оболочки верхних дыхательных путей, готовят мазки на предметных стеклах, подсушивают на воздухе, фиксируют ацетоном при комнатной температуре и исследуют методом иммунофлуоресценции.

Лабораторную диагностику инфекционного бронхита кур можно проводить по двум направлениям:

-обнаружение вирусного антигена в патматериале с последующим выделением вируса на РКЭ и его идентификацией серологическими реакциями;

-выявление специфических антител в крови больных и переболевших животных или в желтках яиц от больной птицы.

Обнаружение вируса в патматериале проводят в ходе постановки РИФ с исследованием мазков из смывов со слизистых оболочек верхних дыхательных путей.

Выделение вируса осуществляют путем заражения РКЭ 8-10-дневного возраста в аллантоисную полость. Для этого используют 5-10 куриных эмбрионов, которые инкубируют при 37ºС. Спустя 1-3 дня после заражения треть эмбрионов убивают путем охлаждения при 4ºС и отбирают аллантоисную жидкость и хорион-аллантоисную оболочку для следующего пассажа. Остальную часть эмбрионов вскрывают на 7-8-й день и исследуют на наличие макроскопических изменений. Обычно вирус инфекционного бронхита кур требует определенное время для адаптации, поэтому иногда при выделении полевых изолятов вируса приходится делать не менее 6-8 слепых пассажей до появления характерных для вируса инфекционного бронхита кур патологических изменений: карликовость эмбрионов с массой 8-14 г вместо 35 г, перекручивание шеи и прилипание лапок к голове. Свернувшиеся в клубок инфицированные зародыши округлой формы, уплотненной консистенции, оболочка амниотической полости утолщена и имеет фибринозные налеты. Эффект карликовости эмбрионов является патогномоничным признаком для вируса инфекционного бронхита кур.

Для подтверждения наличия вируса в экстраэмбриональной жидкости ставят РГА, предварительно обработав материал трипсином.

Параллельно с выделением вируса на РКЭ целесообразно ставить биопробу на 10-25-дневных цыплятах, которых заражают интратрахеально по 0,- 0,3 мл вируссодержащей суспензии. Использование культур клеток имеет особенности, так как вирус инфекционного бронхита кур приобретает способность размножения в культурах клетках только после длительной (6-10 пассажей) адаптации. Лучшей из них является культура трахеи 20-дн эмбрионов, в которых вирус вызывает стаз ресничек эпителия.

Идентификацию изолированного вируса осуществляют в серологических реакциях, наиболее важными из которых являются РИД, РН, РИФ и РТГА. Реакция иммунодиффузии идентифицирует вирус инфекционного бронхита кур без определения его типовой принадлежности, так как используемая в реакции специфическая сыворотка реагирует с вирусом болезни независимо от его серологической идентичности. Испытуемым антигеном в реакции являются сус-

55

снижением яйценоскости.

Возбудителем инфекционного бронхита кур является вирус из семейства Coronaviridae, рода Coronavirus. Это РНК-геномный вирус, содержащий односпиральную молекулу плюс-нити РНК. Вирус является сложноорганизованным с наличием суперкапсида. В составе вируса инфекционного бронхита кур обнаружено два основных гликопротеина, один из которых расположен на поверхности вириона (S- белок), а второй – на поверхности капсида (М- белок). При этом поверхностный гликопротеин имеет пять центров, взаимодействующих с антителами (пять эпитопов), обозначаемых как А-Е. Первые четыре не подвержены изменчивости и остаются постоянными в пределах вирусной популяции одного серотипа. Совокупность поверхностных эпитопов определяет антигенную структуру вируса инфекционного бронхита кур. До настоящего времени выделено не менее 7 основных серотипов вируса: A, B, C, D, Массачусетс, ИК11, ИК12, а также некоторые другие подтипы внутри указанных типов. Выделяемые от кур на территории СНГ штаммы вирусов инфекционного бронхита кур в большинстве случаев относят к серотипу Массачусетс. Однако в практических условиях серологическое типирование является затрудненным в связи с различной антигенной активностью штаммов вируса в разных серологических реакциях.

Вирус обладает тропизмом к эпителиальным клеткам трахеи, отдельные штаммы имеют нефрогенную тропность. Кроме того, вирус инфекционного бронхита кур способен локализоваться в лейкоцитах и эритроцитах, что наблюдают в начальный период развития болезни. Вирус способен длительно персистировать в клетках почек и легких у переболевшей птицы, что обусловливает высокий процент носительства вируса у птицы.

Вирусные частицы имеют на своей поверхности молекулы гемагглютинина, однако они скрыты молекулами фосфолипидов и суперкапсидных белков. В этой связи появление гемагглютинирующей активности у вируса возможно только после обработки вириона фосфолипазой и трипсином.

Обычно выделение вируса и серологическая диагностика болезни представляет значительные трудности в связи с широким применением живых и инактивированных вакцин.

Отбор патматериала. Для исследования от больной птицы берут смывы с трахеи и гортани во время инкубационного периода или проявления ярких клинических признаков. От вынужденно убитых животных берут кусочки легких, почек, соскобы с трахеи, гортани и бронхов; от взрослой птицы

– почки и яйцеводы. В период острого течения болезни вирус может быть выделен из яиц. Испытуемый материал до исследования можно хранить при температуре минус 20-70ºС в течение 1 недели.

Подготовка материала заключается в приготовлении 10%-ной суспензии на растворе Хенкса или изотоническом буферном растворе. После этого ее центрифугируют в течение 15 минут при 2-3 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость обрабатывают антибиотиками (2000 ЕД/мл пенициллина и 1 мг/мл стрептомицина) в течение 1,5-2 часов в холодильнике (4ºС), после чего используют для заражения чувствительной системы. Из осадка, полученного

54

-смывы со слизистой оболочки носовой полости путем введения стерильного ватно-марлевого или поролонового тампона в носовые ходы;

-смывы с конъюнктивы;

-смывы со слизистой оболочки прямой кишки.

От животных, убитых с диагностической целью, берут кусочки легких и бронхов (на границе пораженных и здоровых участков), селезенки, лимфоузлов. Кусочки материала массой до 20 г помещают в стерильную посуду, которую помещают в термос со льдом. Если доставка материала в течение одних суток невозможна, то материал консервируют более низкой температурой – минус 20-30ºС.

Подготовку материала для исследования проводят по общей схеме. Она включает центрифугирование жидкого материала при 1000 об/мин в течение 10-15 минут, обработку надосадочной жидкости антибиотиками. В дальнейшем надосадочную жидкость используют для выделения вируса, а осадок дважды промывают физиологическим раствором с последующим нанесением небольшого количества материала на предметные стекла (получение мазков из патматериала).

Лабораторная диагностика ПГ-3 может проводиться по следующим направлениям:

-обнаружение вируса в патологическом материале методом РИФ;

-выделение возбудителя на культурах клеток и его идентификация;

-выявление специфических антител в крови животных.

Обнаружение вируса в патматериале осуществляют путем постановки РИФ. Необходимо иметь в виду, что вирус ПГ-3 чаще всего может быть обнаружен в эпителиальных клетках носовых ходов и ротоносоглотки, а также легких, поэтому исследуют в РИФ мазки, приготовленные из этих органов по вышеописанной методике. После приготовления мазки высушивают на воздухе, фиксируют в охлажденном (минус 10-20°С) ацетоне в течение 20-30 минут, после чего обрабатывают флюоресцирующими сыворотками из диагностического набора для диагностики ПГ-3. После обработки в течение 45 минут в условиях влажной камеры и 37ºС препарат исследуют в люминесцентном микроскопе. В положительном случае вирус обнаруживают в цитоплазме пораженных клеток.

Выделение вируса. Наиболее часто для выделения используют первичные субкультуры: ПЭК, ЛЭК, ПТ, ТБ. Цитопатическое действие, вызываемое вирусом ПГ-3, характеризуется образованием синцития и вакуолей.

Одновременно с выявлением ЦПД, начиная с 3-5 дня после заражения, проводят РГАд с целью обнаружения присутствия гемагглютинирующего вируса. Для постановки РГАд используют 0,5%-ную взвесь эритроцитов морской свинки. При обнаружении ЦПД и феномена гемадсорбции проводят параллельное культивирование зараженных материалом культур клеток на предметных стеклах, которые через 18-24 часа исследуют в РИФ по вышеописанной методике. Обнаружение специфического ЦПД, феномена гемадсорбции в зараженных культурах клеток и получение положительного результата РИФ дает основание предполагать присутствие вируса ПГ-3 в материале.

Идентификацию вируса проводят серологическими реакциями - РТГАд, РТГА. Последнюю применяют для типирования выделенного на культуре клеток гемадсорбирующего вируса. В реакции возможно использование только эритроци-

15

тов морских свинок, гусей и индюков. При этом гемагглютинация наступает через 60-90 минут, 1-3 минуты и 2-5 минут соответственно. Иммунные сыворотки, используемые в РТГА, обязательно должны быть освобождены от ингибиторов путем прогрева при 56ºС в течение 30 минут и обработаны каолином или фильтратом холерного вибриона.

Ретроспективная серодиагностика основана на выявлении специфи-

ческих антител в крови животных. При этом оценивают динамику изменения титра антител в парных пробах сыворотки крови, взятых в начале болезни (не позднее 4-5 дня) и повторно через 2-3 недели. Выявление антител проводят в серологических реакциях РТГА, РТГАд, однако первой отдается предпочтение.

Положительным результатом считают 4-кратное и более увеличение титра антител при исследовании парных проб сывороток крови или носовых секретов.

ЛЕКЦИЯ 3. ВИРУСЫ ДИАРЕИ, АДЕНОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Вирусная диарея – инфекционная болезнь крупного рогатого скота, преимущественно молодых животных (2 мес. – 2 года), характеризующаяся эрозивно-язвенным воспалением слизистых оболочек пищеварительного тракта, ринитом, высокой лихорадкой, лейкопенией, постоянной диареей, эрозив- но-язвенным стоматитом, у коров возможны аборты.

Возбудителем вирусной диареи крупного рогатого скота является вирус семейства Flaviviridae, рода Pestivirus. Кроме возбудителя вирусной диареи крупного рогатого скота данный род включает возбудителей классической чумы свиней и пограничной болезни овец. В пределах рода пестивирусы связаны общностью антигенной структуры, поэтому антитела против вируса классической чумы свиней способны нейтрализовать вирус диареи. Вирусу диареи характерен тропизм к клеткам слизистых оболочек желудочнокишечного тракта и дыхательных путей, а также способность длительно сохраняться и реплицироваться в иммунокомпетентных клетках, что оказывает значительное иммунодепрессивное действие в патогенезе болезни. Подавление гуморальных механизмов иммунитета и защиты приводит к активизации присутствующих в организме микроорганизмов и вирусов, в частности герпесвирусов (чаще вируса ИРТ). Кроме того, это свойство вируса вызывает исчезновение вирусоспецифических антител в крови животных хронически больных вирусной диареей.

Разные штаммы вируса диареи различаются по вирулентности, тропизму, но идентичны в антигенном отношении, то есть наличие серовариантов возбудителя не установлено.

Кроме различий по вирулентности и тропизму установлено наличие двух типов вируса диареи, отличающихся по цитопатогенному действию: одни вызывают образование ЦПД на культурах клеток (цитопатогенные штаммы), другие – не обладающие цитопатогенностью. Последние чаще имеют в

16

30% зараженных эмбрионов.

Одновременное использование обоих методов заражения РКЭ дает возможность выделить как клеточно-свободный вирус из перьевых фолликулов (на ХАО), так и клеточно-связанный вирус из внутренних органов больной птицы (путем заражения в желточный мешок).

При отсутствии РКЭ возможно проводить выделение вируса на культурах клеток. С этой целью используют первичные культуры клеток почек куриных эмбрионов или цыплят, культуры фибробластов куриных или утиных эмбрионов. Культивирование клеток лучше проводить в небольших матрасах или чашках Петри. Для последующей идентификации в РИФ в посуду с культурами клеток помещают покровные стекла. Материалом для заражения служит суспензия, приготовленная из пораженных органов (чаще почек) по вышеописанной методике (см. в разделе «Подготовка материала»).

Способ заражения клеточных культур зависит от исследуемого материала: при выделении вируса из клеток (клеточно-связанный вирус) взвесь их добавляют в культуру и оставляют на 12-24 часа, после чего питательную среду меняют. Бесклеточные материалы (клеточно-свободный вирус) вводят непосредственно на отмытый слой клеток в течение 30 минут при 37ºС, а затем добавляют поддерживающую среду.

При первичном выделении вируса болезни Марека ЦПД в первом пассаже не проявляется, поэтому на 7-8-й день проводят второй пассаж, заражая новый монослой суспензии клеток, полученной путем добавления 0,125%-ного раствора трипсина в монослой первого пассажа (концентрация суспензии должна составлять 3-4 млн клеток на один монослой). Таким образом, проводят культивирование вирусов не менее чем в трех пассажах. ЦПД, вызываемое вирусом болезни Марека, характеризуется образованием фокусов из округленных рефрактильных клеток, синцитиев и микроскопически видимых бляшек. В зараженных клетках появляются внутриядерные включения.

Идентификацию выделенного вируса осуществляют (1) в РИД с исследованием суспензии (1:3) хорион-аллантоисной оболочки в смеси с экстраэмбриональной жидкостью или РРИД (реакция радиальной иммунодиффузии), а также

(2) в РИФ с исследованием зараженного вирусом клеточного монослоя на покровных стеклах.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика основана на выявлении специфических антител в сыворотке крови с помощью РИД или ИФА. При этом необходимо иметь в виду, что антител образуются в организме на попадание любого штамма вируса с различной онкогенностью, поэтому значение серодиагностики невелико.

Инфекционный бронхит кур - высококонтагиозная болезнь кур, проявляющаяся у цыплят респираторной или нефрозо-нефритной формами, а у кур – поражением органов размножения.

Первые две формы наблюдают у цыплят до 2-3- месячного возраста и характеризуются высокой летальностью. Поражение репродуктивных органов регистрируется обычно у кур старше 6 мес., и заболевание протекает бессимптомно или с незначительным поражением органов дыхания, характеризуется длительным

53

- выявление антител к вирусу у птиц РИД в геле и ИФА.

Обнаружение возбудителя в патматериале проводят несколькими способами. Экспресс-диагностика болезни Марека заключается в обнаружении вирусного антигена в препаратах из перьевых фолликулов методом иммунофлуоресценции. При этом РИФ применяют в прямом и непрямом вариантах с использованием приема контрастирования фона бычьим альбумином, меченым родамином. В положительных случаях специфическое свечение в виде светящегося ободка регистрируют в цитоплазме клеток в перинуклеарной зоне.

Кроме того, обнаружение вирусного антигена возможно реакцией иммунодиффузии, в которой исследуют суспензию из эпителия перьевых фолликулов. Последнюю готовят следующим образом: 10-15 очинов перьев измельчают ножницами на кусочки размером 1-2 мм, затем растирают в ступке, заливают физиологическим раствором 1:10, три раза замораживают и оттаивают, после чего выдерживают сутки при 4ºС. Образовавшуюся надосадочную жидкость используют в качестве антигена.

Гистологический метод в диагностике болезни Марека играет важную роль. При этом патогистологические изменения в нервах характеризуются инфильтрацией лимфоидными клетками. Изменения в коже характеризуются образованием лимфоидных фокусов вблизи перьевых фолликулов. Патологические изменения фабрициевой бурсы характеризуются либо дегенерацией, либо пролиферацией лимфоидных органов, а также атрофией, образованием кист, очаговым некрозом.

Выделение вируса проводят путем заражения исходным материалом РКЭ, при этом биопробу ставят одновременно в двух вариантах. Первый вариант заключается в заражении 10-15 эмбрионов (10-12- дневных) на ХАО, используя для этого клеточно-свободный фильтрат (приготовление суспензии из материала для заражения ХАО см. выше). При наличии в исследуемом материале вируса болезни Марека на 7-8-й день культивирования по всей поверхности оболочки появляются очаги клеточной пролиферации в виде пустул и бляшек диаметром 1-3 мм, у эмбриона отмечают спленомегалию и поражение печени. Гибель эмбрионов считают специфической через 72 часа после заражения.

Второй вариант заключается в заражении 10-15 развивающихся куриных эмбрионов 4-5- дневного возраста в желточный мешок. При этом материалом для заражения служат смесь равных частей стабилизированной крови и 10%-ной суспензии внутренних органов. Инкубацию эмбрионов осуществляют в течение 13-14 дней, при этом гибель их считается специфической только с 8-9-го дня инкубации.

Инфицированные эмбрионы исследуют на 12-й день после заражения. При этом обращают внимание на очаговое поражение хорион-аллантоисной оболочки с их подсчетом: (-) – поражения отсутствуют, (+) – от 1 до 20 очагов; (++) – от 21 до 100 очагов; (+++) – более 100 очагов на поверхности хорионаллантоисной оболочки. Положительным считают результат исследования, при котором выявлено очаговое поражение ХАО на ++ и более примерно у

52

организме тропизм к клеткам иммунной системы и вызывают латентную персистирующую инфекцию без формирования антител. Предполагают, что для проявления клинически выраженной формы болезни необходимо первоначальное заражение животного нецитопатогенным штаммом с последующим инфицированием вирулентным цитопатогенным штаммом вируса.

Лабораторная диагностика. В лабораторию направляют патматериал от больных животных, взятый в первые 2-3 дня болезни при выраженных симптомах болезни, или от животных, убитых с диагностической целью в период острой стадии болезни. От больных животных берут 15-20 проб материала: смывы со слизистой оболочки носовой полости, соскобы с изъязвленных или эрозивных участков слизистой оболочки ротовой полости и носового зеркала, взятые жестким ватномарлевым тампоном или скальпелем. Тампоны помещают в стерильные пенициллиновые флаконы или пробирки с 2-3 мл стерильного физиологического раствора или раствора Хенкса, содержащего 500-1000 ЕД/мл антибиотиков. От убитых животных отбирают кусочки легких с бронхом, селезенки, обязательно лимфоузлы, пораженный участок желудочно-кишечного тракта. Учитывая тропизм вируса диареи к иммунокомпетентным клеткам крови, в лабораторию также направляют пробы крови. Для этого в начале болезни в период подъема температуры от больных животных берут пробы крови, которые смешивают с раствором цитрата натрия или гепарина и помещают в термос со льдом.

Лабораторную диагностику вирусной диареи проводят по следующим направлениям:

-первичное обнаружение вируса в патматериале реакцией иммунофлуоресценции;

-изоляция вируса на культурах клеток с его идентификацией;

-обнаружение специфических антител в крови животных (ретроспек-

тивная серодиагностика).

Обнаружение вируса в патматериале осуществляют в РИФ. Для этого исследуют препараты-отпечатки из патматериала, а при жизни животного – биопсийный материал слизистых оболочек ротовой и носовой полостей, а также носоглоточные смывы. При исследовании обращают внимание на свечение антигена в цитоплазме неразрушенных клеток. Яркая зеленая флуоресценция в виде гранул или диффузного свечения цитоплазмы не менее чем в 10% клеток позволяет оценить препарат как положительный. Предварительный диагноз на болезнь ставят при наличии не менее 30% положительных препаратов от общего числа исследованных проб.

Выделение вируса осуществляют на первичных и субкультурах клеток эмбриона крупного рогатого скота (ПЭК, ЛЭК, СЭК) или ТБ. При выделении вируса диареи следует иметь в виду существование цитопатогенных и нецитопатогенных штаммов вируса - первые способны вызвать развитие ЦПД в виде появления мелкозернистой инфильтрации в клетках с последующим их отторжением от стекла. Причем к концу культивирования остается только сеть зернистого материала.

Идентификацию вируса диареи проводят в РИФ, однако основным методом идентификации является РН.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. Диагноз на прошед-

17

шую инфекцию, а также латентное вирусоносительство ставят при помощи РН в культурах клеток, определяя титры антител в сыворотках крови животных. При этом исследуют пробы сывороток как при однократном, так и при двукратном взятии. Для диагностики скрытого течения инфекции чаще исследуют сыворотку крови убойного скота, поступающего с клиникой поражения кишечного и респираторного трактов невыясненной этиологии. Исследуемую сыворотку в реакции используют в разведениях от 1:2 до 1:32. Положительными считают сыворотки с титром антител в РН 1:16 и выше, в парных пробах

– с повышением титра антител в 4 и более раз во второй пробе.

Кроме РН, возможно использование РСК, которую ставят микрометодом в микротитраторе Такачи, а также пробирочным методом. Положительной считается реакция с полной задержкой гемолиза в ряду с исследуемой сывороткой в разведении 1:2 и выше. При частичной задержке гемолиза в этом разведении реакция считается сомнительной, и проводят повторное исследование. Вторично полученный сомнительный результат считают отрицательным.

Аденовирусная инфекция – остро протекающая болезнь молодняка крупного рогатого скота, характеризующаяся поражением органов дыхания и пищеварения, конъюнктивитами. К болезни восприимчив молодняк с 2- недельного возраста до 4-х месяцев, животные старшего возраста являются вирусоносителями.

Возбудителем аденовирусной инфекции (АВИ) крупного рогатого скота является ДНК-геномный вирус из семейства Adenovirus, род Mastadenovirus. В семействе также имеется род Aviadenovirus, вызывающий аденовирусную инфекцию у птиц. Возбудитель аденовирусной инфекции крупного рогатого скота содержит белки, некоторые из них обладают антигенными свойствами и стимулируют выработку антител, выявляемых в различных серологических реакциях. Наибольшее значение имеют белки трех типов: А, В и С. Антиген А присутствует во всех штаммах аденовирусов, причем различают его два иммунологических подтипа. Функционально они являются комплементсвязывающими и преципитирующими антителами и могут быть выявлены в РСК и РИД. Наличие двух разновидностей антигена А дало возможность разделить все штаммы на две антигенные подгруппы, обозначаемые как подгруппы I и II. Антиген В является токсическим фактором, ответственным за ранний цитопатический эффект.

Антиген С является типоспецифическим и выявляется в РН и РТГА. Выделяют 10 разновидностей антигена С, что позволило разделить все штаммы аденовирусов на 10 серотипов. Установлено, что серотипы 1,2 и 3 имеют общий комплементсвязывающий антиген А, поэтому они объединены в первую (I) антигенную подгруппу. Все остальные штаммы содержат комплементсвязывающий антиген второго типа, поэтому они объединены во вторую серологическую подгруппу.

В ветеринарной практике типизацию выделенных аденовирусов проводят чаще по РСК, поэтому ограничиваются установлением принадлежности выделенного аденовируса к одной из подгрупп (I и II). Более подробную типи-

18

от В и С, которые связаны с зараженной клеткой. Вышеуказанный антиген А является общим для всех штаммов вируса, поэтому различий в антигенной характеристике вируса болезни Марека нет.

Отбор патматериала. В лабораторию направляют 5-10 клинически больных цыплят, от которых берут кровь и в обязательном порядке перья. С этой целью от каждой птицы с наружной поверхности бедра выщипывают по 10-15 перьев с наличием производящей ткани (эпителий перьевых фолликулов) внутри очина. После вскрытия отбирают кусочки пораженных внутренних органов, кожи, мышц и периферических нервов. Патологический материал должен быть происследован не позднее 2-3 часов после взятия.

Часть крови отстаивают для получения сыворотки, а остальную стабилизируют добавлением 15-20 ЕД/мл гепарина или 5%-ным раствором цитрата натрия

всоотношении 1:9. Кроме патматериала, отобранного по вышеописанной методике, в лабораторию направляют для гистологического исследования пробы материала размером 1х2х2 см, фиксированные в 10%-ном нейтральном растворе формалина.

Подготовка материала. Успешное выделение вируса болезни Марека зависит от правильности подготовки патматериала. Из проб внутренних органов готовят 10%-ную суспензию на растворе Хенкса с добавлением антибиотиков. Затем к приготовленной суспензии добавляют равный объем стабилизированной крови. Приготовленный таким образом материал можно использовать для заражения РКЭ

вжелточный мешок.

При подготовке материала из перьевых фолликулов важным является получение суспензии, содержащей клеточно-свободный вирус. Для этого пробы пера (10-15 очинов) выдерживают 30 минут в дистиллированной воде с антибиотиками (по 1000 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина, 50 ЕД/мл нистатина), затем содержимое очинов пинцетом выдавливают в ступку и тщательно растирают, добавляя 10 мл физиологического раствора. Приготовленную суспензию центрифугируют 20 минут при 20 минут при 3000 об/мин. Полученную надосадочную жидкость используют для заражения РКЭ на хорион-аллантоисную оболочку.

Подготовка проб почек для исследования включает тщательное отмывание проб раствором Хенкса, после чего их заливают 0,25%-ным раствором трипсина в соотношении 1:10 для проведения трипсинизации в течение 20-30 минут при 2225ºС. Клеточную взвесь фильтруют через марлю, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут, а осадок ресуспендируют в питательной среде до концентрации 3-4 млн клеток в 1 мл. Добавляют антибиотики по 1000 ЕД/мл, выдерживают 60 минут при 4ºС и используют для заражения культур клеток.

Из проб материала, доставленного для гистологического исследования, готовят замороженные или парафиновые срезы, которые после обработки окрашивают гематоксилин-эозином.

Лабораторная диагностика болезни Марека включает:

-первичное обнаружение возбудителя в патматериале методом иммунофлуоресценции и реакцией иммунодиффузии, обнаружение характерных патогистологических изменений с последующим выделением вируса на чувствительных тест-объектах и его идентификацией;

51

Возбудителем болезни Марека является вирус безымянного рода, подсемейства Alphaherpesvirinae, семейства Herpesviridae. Это ДНК-геномный вирус, имеющий в составе вириона линейную двунитчатую молекулу ДНК. Кроме возбудителя болезни Марека, в данный род также включен возбудитель злокачественной катаральной горячки.

Вирус болезни Марека обладает выраженными онкогенными свойствами, поэтому вызываемое им заболевание является опухолевым по природе. В этой связи патогенность возбудителя определяется главным образом способностью вируса вызывать трансформацию клеток-мишеней в опухолевые (это свойство иначе называют онкогенностью). Также установлено, что не все штаммы вирусов болезни Марека обладают выраженными онкогенными свойствами, поэтому их принято разделять на высокоонкогенные, неонкогенные и отдельно группу вирусов, вызывающих схожее заболевание у индюков (герпесвирусы индюков). Неонкогенные штаммы вируса не обладают патогенностью и поэтому являются авирулентными.

Установлено, что все онкогенные штаммы вируса болезни Марека содержат в составе генома участки, кодирующие специфические антигенные детерминанты, в частности гликопротеид gp5. Поэтому различия в составе этого гликопротеида позволяют на молекулярном уровне разграничивать высоко - и низкоонкогенные штаммы вируса, а также установить принципиальное отличие классического вируса болезни Марека от герпеса индеек.

Вирус болезни Марека в организме зараженной птицы существует в двух формах: тесно связанного с клеткой (интегрированный вирус) и свободного от интеграции с клеточным геномом. Первую форму иначе называют клеточно-связанным вирусом, она обусловливает в основном персистентную форму инфекции, при которой вирусный геном интегрируется с геномом лимфоцитов тимуса, селезенки или бурсы. Установлено, что в геном одной клетки интегрируется от 3 до 12 полных геномов вируса болезни Марека – в таком состоянии он может персистировать пожизненно. Выделение из материала клеточно-связанного вируса обычно представляет большую сложность.

Второй формой существования, характерной высокоонкогенным штаммам вируса, является клеточно-свободная форма. Вирусы этой формы представляют собой активно реплицирующийся геном. Чаще всего вирус размножается в клетках лимфоидных органов (фабрициева сумка, селезенка, тимус, миндалины, слепая кишка), эпителиальных клетках почечных фолликулов. В последних вирус обнаруживается у птиц всех возрастов независимо от метода заражения и форм проявления заболевания. В этой связи исследование перьевых фолликулов кожи достоверно дает возможность судить о зараженности птицы онкогенными штаммами вируса. Авирулентные слабоонкогенные штаммы вируса, а также вирусы герпеса индеек в эпителии перьевых фолликулов никогда не размножаются.

Обычно выделить вирус болезни Марека в клеточно-свободной форме значительно легче, чем в состоянии интеграции с геномом клеток.

В составе вируса выявлено 6 антигенов, из которых антигены А, В и С имеют наибольшее значение. Антиген А входит в состав вириона в отличие

50

зацию (по 10 серотипам) в РН и РТГА проводят реже.

Аденовирусов крупного рогатого скота не способны инфицировать лабораторных животных и РКЭ, поэтому тканевые культуры являются единственной биологической системой для культивирования вируса. В ходе репродукции аденовирусы вызывают развитие в них ЦПД и образование внутриядерных включений. При этом аденовирусы первой подгруппы (серовары 1, 2 и 3) индуцируют образование одного внутриядерного включения неправильной формы на культурах клеток ПЭК, ЛЭК и ТБ. Аденовирусы второй подгруппы продуцируют большое число внутриядерных включений в одной клетке правильной округлой формы, однако они более требовательны к культурам клеток (медленно репродуцируются в культурах клеток ТБ и не размножаются в ПЭК). Гемагглютинирующие свойства аденовирусов КРС неодинаковы, поэтому использование РТГА в ветеринарной практике весьма ограничено. Аденовирусы обладают онкогенными свойствами и способны при введении вызывать образование опухолей у лабораторных животных.

Лабораторная диагностика. Решающее значение в постановке диагноза на аденовирусную инфекцию имеет лабораторное исследование, так как сходную патологию могут вызвать вирусы других таксономических групп: парагрипп-3, диареи, респираторно-синцитиальной инфекции и др.

Отбор патматериала производится аналогично, как и при пара- гриппе-3.

Подготовка материала по общепринятой методике и включает центрифугирование жидкого материала при 1000 об/мин в течение 10-15 минут. В дальнейшем надосадочную жидкость используют для выделения вируса на культурах клеток, а осадок - для приготовления мазков с целью индикации вирусного антигена в РИФ. Для этого к осадку добавляют 0,5мл физиологического раствора и делают 12 мазков на предметном стекле из каждой пробы.

Из патматериала (кусочки органов) также готовят препаратыотпечатки или гистосрезы для иммунофлуоресценции, а затем после измельчения приготавливают 10%-ную суспензию для заражения культур клеток. Полученные мазки, отпечатки, срезы подсушивают в струе воздуха вентилятора, фиксируют в охлажденном ацетоне 20-30 минут и обрабатывают флуоресцирующими сыворотками против I и II подгрупп аденовирусов в течение 45 минут при 37ºС. После трехкратного промывания препаратов в физиологическом растворе его микроскопируют в люминесцентном микроскопе. Яркая зеленая флуоресценция в виде гранул различной формы и величины в ядре и цитоплазме не менее чем 10% клеток позволяет оценить препарат как положительный. Предварительный диагноз ставят при наличии не менее 30% положительных препаратов от общего количества исследованных проб.

Выделение вируса. Аденовирусы изолируют на первичнотрипсинизированных или субкультурах клеток эмбрионов крупного рогатого скота (почки, легкие, селезенка) или ТБ. Каждой пробой материала инокулируют не менее 4 пробирок с монослоем. Наблюдение за зараженными культурами клеток проводят в течение 7-14 суток, ежедневно просматривая монослой под малым увеличением микроскопа для выявления ЦПД, которое ха-

19

рактеризуется дегенерацией монослоя в виде разбухания клеток, их округления и собирания в конгломераты, похожие на гроздья винограда. Изолят считается выделенным в случае появления однотипного ЦПД не менее чем в 3 последовательных пассажах. В случае обнаружения характерного ЦПД проводят заражение монослойной культуры клеток, выращенной на покровных стеклах для последующей идентификации вируса в РИФ. Постановку РИФ осуществляют по вышеописанной методике исследования препаратовотпечатков.

Идентификацию вируса осуществляют в РСК или РИД. При этом в реакциях обязательно используют два типа сывороток из-за различия комплементсвязывающих и преципитирующих антигенов аденовирусов I и II подгрупп. Постановку РСК проводят по общепринятой методике, по результатам которой идентифицируют аденовирус и устанавливают его принадлежность к одной из подгрупп.

Реакция связывания комплемента также позволяет обнаруживать и идентифицировать полевые штаммы аденовирусов непосредственно в патматериале. Однако отрицательный результат РСК при обнаружении вируса в материале не дает основания для общего отрицательного результата исследования.

Идентификацию вируса также проводят в РИД, однако штаммы аденовирусов, принадлежащих II серогруппе, проявляют низкую активность в реакции с гомологичными сыворотками и дают ложно отрицательный результат. В качестве испытуемого антигена в реакциях (РСК и РИД) используют культуральную вируссодержащую жидкость, которую дополнительно концентрируют центрифугированием.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. При положитель-

ном результате выделения и идентификации вируса для окончательной постановки диагноза необходимо провести исследование парных проб сывороток крови больного животного, от которого вирусологическим методом был изолирован аденовирус. Отбор парных проб сывороток крови проводят по общепринятой методике, которые исследуют в РСК или РИД, реже – в РНГА. Диагностическое значение имеет 4- кратное и более нарастание титра антител во второй пробе.

ЛЕКЦИЯ 4. ВИРУСЫ ОСПЫ МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ПТИЦ. ВИРУС ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Оспа млекопитающих и птиц – острая контагиозная болезнь, протекающая с характерными стадийными поражениями кожи различных участков тела и слизистых оболочек.

Особенностью патологических изменений при оспе является их стадийность: розеола (локальное покраснение участка кожи), папула (уплотнение участка кожи за счет клеточной инфильтрации), везикула (наполнение его везикулярной серозной жидкостью), пустула (переход серозного воспаления в гнойное) и круста (появление корочек на месте поражения). У птиц, кроме

20

с некротическим центром вызываются высоковирулентными штаммами вируса. Появление на ХАО мелких узелков без некроза обычно наблюдают при заражении эмбрионов вирусами, выделяемыми в конце эпизоотической вспышки болезни.

В случае отсутствия вышеотмеченных изменений на ХАО проводят второй пассаж путем заражения второй партии эмбрионов суспендированной в аллантоисной жидкости хорион-аллантоисной оболочки предыдущего пассажа. Для выявления специфических обнаружений рекомендуется проведение не менее трех пассажей.

При выделении вируса инфекционного ларинготрахеита на культурах клеток эмбрионов или цыплят через 24-72 часа обнаруживают появление многоядерных гигантских клеток, в которых обнаруживают внутриядерные включения.

Идентификацию вируса проводят в РИД, РИФ или РН. При постановке РИД используют 1,5%-ный агаровый гель, приготовленный на вероналовом буфере. Обычно для идентификации вируса используют набор куриных антисывороток, полученных к различным вирусам птиц, что позволяет дифференцировать изолированные вирусы.

Результаты РН на развивающихся куриных эмбрионах оценивают по индексу нейтрализации: от 1 до 9 считают отрицательным, от 10 до 49 – сомнительным, свыше 50 – положительным.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика заключается в выявлении специфических антител в сыворотке крови больной птицы. В серологических реакциях определяют титры антител и устанавливают их прирост при исследования парных проб сывороток крови, что свидетельствует о наличии и распространенности инфекции в хозяйстве, а сохранение или снижение уровня антител – о прошедшей инфекции. Для серологической диагностики применяют РН, РИД, РИФ или ИФА.

Болезнь Марека - высококонтагиозная болезнь кур и индеек, проявляющаяся в двух формах – классической в виде поражения нервной системы и острой в виде лимфоидного лейкоза.

Наличие двух форм клинического проявления обусловлено в первую очередь вирулентностью вируса, а также чувствительностью птицы. При классической форме болезнь Марека характеризуется хромотой, парезами, параличами крыльев, шеи и хвоста. У больной птицы также изменяется цвет радужной оболочки за счет инфильтрации тканей глаза опухолевыми клетками (обычно лимфоидными и псевдоэозинофильными клетками). Поражения нервной системы обусловлены лимфоидно-клеточной инфильтрацией нервных волокон.

Острое течение характеризуется преимущественно опухолевой инфильтрацией внутренних органов и в значительно меньшей степени – центральной и периферической нервной системы. Остро болезнь протекает чаще у птиц до половозрелого возраста с наибольшим процентом гибели больных животных. При этом формирующиеся опухоли по природе также являются лимфоидными.

49