Genetika_cheloveka_Shevchenko

Программа "Геном человека"

73

Помимо задачи картирования генов и установления их структуры, программа "Геном человека" ставит цель определить структурно-функциональ- ную взаимосвязь генов. Для решения этой задачи используются совершенно новые подходы, которые просто невозможно было представить себе несколько лет назад. Так, по дефектному ферменту, который является причиной наследственного заболевания, зная последовательность аминокислот в его составе, можно искусственно синтезировать информационную РНК, а затем соответствующий участок ДНК, идентифицировать его на хромосомной карте, выделить нативный ген и клонировать его вне организма, чтобы установить, в чем причина образования дефектного фермента. Таким способом были изучены гены дистрофии Дюшена, рака молочной железы, мутантной фенилаланингидроксилазы, являющейся причиной наследственной фенилкетонурии, и ряда других генов.

Еще один новый методический подход в изучении функции генов связан с использованием информационно-ком- пьютерных технологий. Этот путь исследований основан на следующем предположении : если у представителей разных систематических групп имеются одинаковые по структуре гены, то они выполняют одинаковую функцию. Таким образом была установлена причина развития рака толстой кишки у человека. Методами клонирования и картирования была изучена структура генов, отвечающих за развитие рака толстой кишки. Затем был проведен поиск в информационном поле с помощью компьютерных технологий. В процессе этого поиска была предпринята попытка найти в геноме дрожжей, который уже полностью расшифрован, гены, сходные по

структуре с исследуемыми генами человека. И они были обнаружены. Оказалось, что у дрожжей такие же гены отвечают за репарацию ДНК. Таким образом, было установлено, что рак толстой кишки связан с мутациями генов, кодирующих ферменты репарации ДНК.

Важнейшую роль в структурных исследованиях генома человека играет изучение его полиморфизма. Популяционный полиморфизм генома человека является основой для понимания принципов молекулярной эволюции, механизмов возникновения патологических мутаций, для оценки факторов риска при воздействии потенциально токсических агентов окружающей среды на человеческий организм, наконец, для понимания основ различной индивидуальной восприимчивости лекарств. Эти исследования получили новый импульс с открытием полиморфных мини- и макросателлитных последовательностей ДНК, которые используют в качестве маркеров при картировании генома человека.

Новым этапом в изучении структур- но-функциональных связей между генами в программе "Геном человека" является возможность клонирования крупных фрагментов генома в специальных векторах, способных размножаться в клетках вместе со встроенными в них фрагментами. В качестве вектора в таких случаях используют искусственные дрожжевые хромосомы, появление которых стало возможным благодаря развитию генетики дрожжей. Использование таких векторов позволяет клонировать фрагменты ДНК длиной до 106 пар оснований. Это создает предпосылки для быстрого выделения нужного фрагмента генома и использования его для структурного или функционального анализа.

74	Глава 3. ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

Использование новых методов в изучении генетики человека позволяет значительно ускорить процесс исследовательской работы и накопить информацию о генах, играющих ключевую роль в регуляции жизнедеятельности клетки. К таким генам относятся гены контроля клеточного цикла, гены, кодирующие компоненты цепи передачи сигнала от клеточной поверхности к аппарату транскрипции в ядре, гены, контролирующие развитие эмбрионов, гены, ответственные за работу защитных систем организма, гены иммунной системы. Активно расширяется представление о генах, повреждение которых приводит к возникновению раковых опухолей, онкогенах, генахсупрессорах, генах клеточной смерти и апоптоза (программируемой гибели клеток). Все более детальным становится знание надмолекулярных уровней организации регуляции экспрессии генов.

Выполнение программы "Геном человека" приближает возможность использования генной терапии для лечения патологий, связанных с изменением наследственной информации. Генная терапия основана на введении в

организм больного искусственных генетических конструкций. Лечебный эффект достигается в результате работы введенного гена либо за счет подавления функции "больного" гена. Современная генная тераиия делает первые шаги и имеет дело с соматическими клетками в постнатальном периоде жизни человека, но в то же время разрабатываются подходы к генной терапии клеток эмбриона.

Для создания генетических конструкций большей частью используются вирусы. При этом из генома вируса вырезается часть генов, ответственных за формирование инфекционных ви-

русных частиц и разрушение инфицированных клеток. Гены, необходимые для переноса и функционирования генетической информации, сохраняются. К ним добавляются клонированные гены, оказывающие лечебный эффект. Одними из наиболее приемлемых для генной терапии окажутся, видимо, аденовирусные векторы, поскольку аденовирусы не встраиваются в геном клетки хозяина, имеют широкий спектр поражения тканей человека и не индуцируют злокачественный рост.

В настоящее время разрабатываются способы для целевой доставки искусственных векторов к тем или иным органам. Для этого используют локальные инъекции, аэрозольный метод, баллистический метод, основанный на обстреле ткани микрочастицами тяжелых металлов (золота, вольфрама), покрытых векторной ДНК.

Результаты генной терапии можно рассмотреть на конкретном примере. У мальчика, больного гемофилией изза дефицита девятого фактора свертывания крови, с помощью биопсии были выделены фибробласты кожи и культивированы в клеточной культуре, В эти клетки был введен искусственный вектор, созданный на основе ретровируса и содержащий гены, которые увеличивают активность девятого фактора. Инфицированные клетки были размножены в клеточной культуре и возвращены в организм мальчика подкожно в районе спины и ягодиц. Клетки прижились, в результате была увеличена активность девятого фактора свертывания крови, и симптомы гемофилии у пациента были сглажены. Таким образом, генно-инженерные работы создают подходы к лечению гемофилии человека.

Генная терапия — направление, появившееся на стыке двух наук: биоло-

Программа "Геном человека"

гии и медицины, пока имеет скромные практические успехи, но с этим направлением связано развитие медицины XXI-ro столетия.

Перспектива использования достижений программы "Геном человека" многопланова: от идентификации генов, ответственных за возникновение наследственных и приобретенных заболеваний, до развития систем лечения, основанных на введении в организм новой генетической информации, корректирующей генетические дефекты (генная терапия), и интенсивных методов диагностики, основанных на выявлении генетических дефектов, и перехода в диагностике к наиболее полному обследованию популяций для выявления предрасположенности к болезни.

Вопросы для самоконтроля

1.Какие особенности строения ДНК позволяют этим молекулам кодировать наследственную информацию, самоудваиваться и мутировать?

2.В чем значение упаковки ДНК в хроматине и хромосомах?

3.Чем гены отличаются от псевдогенов?

4.Сформулируйте понятия: гомологичные и половые хромосомы, аутосомы.

5.Укажите практическое значение выявления полового хроматина.

6.Перечислите современные методы картирования хромосом. Поясните значение каждого метода.

7.В чем преимущество полимеразной цепной реакции?

8.Назовите новые подходы в изучении структурно* функциональных связей между генами в программе "Геном человека". В чем их практическое значение?

Глава 4. ПЕРЕДАЧА ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

Материальной основой биологической преемственности поколений у человека является процесс оплодотворения: слияние гамет — яйцеклетки и сперматозоида — с образованием зиготы. Каждая из гамет приносит равное количество хромосом. Если число хромосом в гамете обозначить буквой п (гаплоидный набор), то число хромосом в зиготе будет равно 2п (диплоидный набор). Образовавшаяся зигота многократно делится митозом и дает начало новому организму. В результате каждого митотического деления из одной клетки образуются две дочерние. Число хромосом в них идентично их числу в родительской клетке, равно как и качественный набор генетического материала. Образование гамет у человека, как и у других многоклеточных эукариотических организмов, связано с мейотическим делением. В результате этого деления количество хромосом в половых клетках уменьшается в 2 раза и становится гаплоидным

(п). Равные по числу хромосом, образовавшиеся гаметы отличаются друг от друга по качеству генетического материала в результате двух видов генетической рекомбинации: независимого распределения гомологичных хромосом к полюсам деления и обмена участками между гомологичными хромосомами в процессе кроссинговера.

Рассмотрим процессы, лежащие в основе передачи генетического материала, с учетом особенностей их протекания у человека.

Митоз. Клеточный цикл

Общепризнано, что митоз — это самый древний способ клеточного раз-

множения, а все остальные формы деления возникли в процессе эволюции как его регуляционные или патологические изменения. В основе этого взгляда лежит представление о митозе как надежном способе распределения наследственного материала между дочерними клетками. Характерной чертой митоза является авторегуляция, проявляющаяся в цикличности протекания событий, связанных с подготовкой клеток к митозу и самим процессом деления. Эта цикличность послужила основанием для возникновения понятия о митотическом цикле.

Известно, что делящаяся клетка, а вместе с ней и ядро, могут находиться в двух состояниях: в митозе (деление) и интерфазе (состояние между двумя митозами). Во время митоза наследственная информация, упакованная в хромосомах, поровну распределяется между дочерними клетками. В интерфазе, когда геном находится в "рабочем состоянии", наследственная информация реализуется. При этом хромосомы переходят в состояние хроматина. Суперспирализованная с помощью специальных белков ДНК, частично раскручивается, сохраняя структуру двойной спирали.

На молекулах ДНК как на матрицах, по принципу комплементарности, синтезируются все три типа молекул РНК: информационная, транспортная и рибосомная. Новосинтезированные молекулы РНК в комплексе с белками дозревают и покидают ядро, попадая в цитоплазму, где с их участием происходит синтез белков.

Митоз. Клеточный цикл

77

Интерфаза подразделяется на три периода; G,, S и G2. В период G, дочерние клетки вступают после митоза. Количество хромосом в них диплоидное, каждая хромосома состоит из одной хроматиды. Соответственно у человека количество двуспиральных молекул ДНК равно 46, по одной нитевидной молекуле на хромосому, перешедшую в состояние хроматина. Объем же клеток, общее содержание органелл, белков и РНК вдвое меньше, чем в исходной родительской клетке. В это время начинается рост клеток за счет накопления клеточных белков, мембранных структур и органелл. Продолжительность периода G) непостоянна, и, в отличие от других фаз клеточного цикла, может изменяться от нулевых значений до многих часов, (в некоторых случаях даже месяцев) в зависимости от сроков эмбрио- и онтогенеза, от особенностей ткани и ряда других факторов.

В S-периоде удваивается ДНК каждой хроматиновой нити, при этом общее количество ДНК возрастает в 2 раза (рис. 4.1). В клетках человека, как и в эукариотических клетках других организмов, репликация ДНК происходит одновременно на множестве отдельных участков вдоль каждой хромосомы с последующим соединением концов, образовавшихся соседних отрезков. За счет того, что репликация происходит в сотнях точек, сокращается время, необходимое для удвоения молекул ДНК, длина которых у человека измеряется в сантиметрах. По данным разных авторов продолжительность S-периода у млекопитающих варьирует в пределах от 7 до 9 ч. Во время и после репликации сестринские хроматиды могут обмениваться сегментами: идет процесс сестринских хроматидных обменов. Так что обе хроматиды митотической хромосомы содержат участки другой хро-

ДНК

i.

G T 1	S	' Gz	'
10ч	9ч	4ч

Рис. 4.1. Изменение содержания ДНК в клеточном цикле

2с — количество ДНК, соответствующее диплоидному набору хромосом; 4с — удвоенное количество ДНК

матиды. В этом можно убедиться с помощью специального окрашивания хромосом (рис. 4.2).

Количество сестринских хроматидных обменов в клеточных культурах человека часто используют в качестве индикатора мутагенности среды : чем больше межхроматидных обменов, тем она выше.

В результате репликации образуются две идентичные молекулы ДНК, упакованные с помощью белков в хроматине. Эти молекулы отделены друг от друга, но остаются соединенными в центромерном районе хромосом. Центромера располагается внутри гетерохроматического района. Предполага-

Рис. 4.2. Сестринские хроматидные обмены в эпителиальных клетках перевиваемой клеточной линии V79. Окрашивание гематоксилином - эозином

78	Глава 4. ПЕРЕДАЧА ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

ХК К

I)к и П н и н

ti13	И14	it15		« УV
				10
It	XX		* *	* *	<1
19	20		21	22

Р и с . 4 . 3 . Репликационная структура метафазных хромосом, выявляемая

после обработки 5 - бромдезоксиуридином. Индивидуальная идентификация всех хромосом набора. Различие гомологичных X - хромосом

ется, что гетерохроматин обеспечивает ее стабильность. В районе центромеры расположена сателлитная ДНК, представленная кластерами высокоповторяющихся последовательностей. Кроме того, внутри центромеры находятся уникальные последовательности ДНК, которые, как полагают, несут информацию о расхождении хромосом к противоположным полюсам клетки.

Наличие множества точек начала репликации ДНК на каждой хромосоме не означает одновременного начала этого процесса в каждой точке. Для репликации в клетках человека характерна асинхронность его в разных уча-

стках хромосом. В то же время порядок репликации участков каждой хромосомы строго постоянен, поэтому воспроизведение его последовательности служит важнейшей характеристикой каждой хромосомы человека.

Первоначально репликацию ДНК в хроматине клеток человека изучали с помощью метода авторадиографии на клеточных культурах, предварительно меченых радиоактивным 3Н-тимиди- ном. Выяснилось, что таким способом можно легко различить морфологически сходные хромосомы №№ 4 и 5, 17 и 18, а также акроцентрические хромосомы №№ 13,14 и 15. Методом автора-

Митоз. Клеточный цикл

79

диографии было также показано, что в женских клетках одна из двух Х-хро- мосом отличается поздним началом репликации и поздним окончанием синтеза ДНК. Аналогичными характеристиками отличаются районы гетерохроматина в X хромосоме человека, что подтверждает идентичность этих структур. Кроме того, метод авторадиографии позволил улучшить идентификацию хромосомных аномалий и помог выявить несколько новых синдромов, связанных с патологией в строении хромосомы.

Новый этап в изучении последова- +елыюсти синтеза ДНК по длине каждой хромосомы человека начался с использованием в качестве предшественника синтеза ДНК аналога тимидина — 5-бромдезоксиуридина. Включившие его вместо тимидина участки хромосом окрашиваются значительно слабее, следовательно, в светлых участках репликация ДНК начинается раньше. Таким образом, цитогенетики получили возможность изучать хронологию репродукции хромосом (рис. 4.3).

Каждая хромосома состоит из участков, реплицированных в разное время. Районы с ранней и поздней репликацией четко чередуютсяч. В метафазной хромосоме расположение светлых и темных участков можно видеть с помощью светового микроскопа. Строгая специфичность картины позволяет уверенно идентифицировать хромосомы в норме, а также при изменении кариотипа в целом, равно как и отдельной хромосомы.

В (^-периоде число молекул ДНК — удвоенное. Количественное содержание ДНК соответствует тетраплоидному (4п) набору хромосом.Уровень синтеза РНК и белка достигает максимума. Клетки готовятся к вступлению в митоз, поэтому иначе эта часть клеточного

Рис.4.4. Схема клеточного цикла. Клеточный цикл включает в себя события: митотический цикл (М, G^, S, G2)

и состояние пролиферативного покоя (R1, R2). 2с - количество ДНК соответствующее диплоидному набору хромосом, 4с - удвоенное количество ДНК

цикла называется премитотическим периодом. Продолжительность G2-nepHo- да у млекопитающих около 4 ч.

Внастоящее время клеточный цикл рассматривают как последовательность хронологически связанных событий, происходящих после завершения митоза в исходной клетке (Rj) вплоть до завершения митоза в ее дочерней клетке (R2) (рис. 4.4).

Вначале 90-х гг. произошел прорыв

визучении регуляторных механизмов размножения клеток. В нормальных условиях координация событий клеточного цикла обусловлена регуляцией трех переходов: вступления в митоз, выхода из митоза и прохождения через пункт ограничения в периоде Gj, после которого клетки ориентируются на синтез ДНК, то есть готовятся вступить в S-период. Так, идентифицирован продукт активности гена, которому принадлежит центральная роль в

регуляции деления. Это белок р34с "с , отличающийся высокой степенью филогенетической консерва-

Интерфаза

Анафаза

Митоз. Клеточный цикл

81

тивности в клетках эукариотических организмов. Показано, что и клетки человека содержат продукт активности данного гена или очень близкий его гомолог. Наиболее вероятно, что функциональная роль этого белка связана с фосфорилированием гистона Н), участвующего в упаковке ДНК в составе хроматина.

Процесс митоза в соматических клетках человека идет стандартно (рис. 4,5). К концу профазы хромосомы становятся отчетливо видимыми, причем каждая состоит из двух хроматид. Обе сестринские хроматиды прилежат Q;uia к другой. Центромера во всех хромосомах представлена небольшой светлой кольцеобразной зоной. Она удерживает две сестринские хроматиды вместе. Ядрышко исчезает, ядерная оболочка распадается на фрагменты. Хромосомы располагаются в цитоплазме центральной части клетки, оттесняя все органоиды к периферии.

Во время метафазы центромеры всех хромосом располагаются в экваториальной плоскости между двумя полюсами клетки. В это время они утрачивают вид четко выраженной перетяжки. Хроматиды каждой хромосомы начинают отделяться одна от другой, оставаясь соединенными только в центромерной области. В районе же центромер с противоположных сторон прикрепляются нити веретена деления. Их количество может достигать нескольких десятков в районе каждой центромеры.

Анафаза начинается с одновременного разделения всех центромер и расхождения сестринских хроматид каждой хромосомы к противоположным полюсам. Утрата синхронности этого процесса может привести к неправильному их расхождению. Центромеры с

Рис.4.6. Одно из первых изображений митоза в сперматогониях человека

помощью специальных белков связываются с нитями веретена деления, которые и увлекают за собой дочерние хроматиды к противоположным полюсам. Анафаза заканчивается с прекращением движения хроматид, которые становятся хромосомами. У каждого полюса клетки должно оказаться по 46 состоящих из одной хроматиды таких хромосом.

Телофаза связана с образованием ядерных оболочек вокруг хромосом на двух полюсах клетки и началом перехода хромосом в состояние хроматина. Завершается телофаза возникновением перетяжки в центральной части делящейся клетки, которая завершает деление клетки надвое.

Самые ранние описания митоза в клетках человека сделаны О.Винивортером в 1912 г. Его рисунок с гистологического препарата семенников можно увидеть на иллюстрации (рис. 4.6). На нем изображен митоз в сперматогонии, и количество хромосом оценивалось автором как 48. Прошло более 50 лет, прежде чем появились методы, позволившие уточнить, что их число в клетках человека равно 46.

Для эукариот известно, что прохождение митоза может быть заблокировано, физиологически или экспериментально, что приводит к развитию полиплоидных клеток. Системная по-