a	t опт
б
V
0	50	100 °C

а – повышение скорости реакции как функция температуры; б – снижение скорости реакции как функция денатурации белка-фермента (стрелка указывает оптимум температуры)

Рисунок 2 – Зависимость скорости катализируемой ферментом реакции от температуры

Наибольшую активность ферменты проявляют в очень узком интервале температур где-то при 40-50°С для животных организмов и 40–60°С для растительных организмов, в этих условиях скорость реакции оказывается максимальной вследствие увеличения кинетической энергии реагирующих молекул. При низких температурах (0°С и ниже) ферменты, как правило, не разрушаются, хотя активность их падает почти до нуля. Каждый фермент имеет свой температурный оптимум.

Следует отметить, что на термолабильность ферментов оказывают влияние время воздействия, концентрация субстрата, pH среды, а также в каком состоянии находится фермент. В кристаллическом виде ферменты более термоустойчивы.

9 Влияние кислотности среды

Важнейшим фактором, влияющим на активность ферментов, является реакция среды. В клетке одновременно присутствуют сотни различных ферментов, и каждый фермент наиболее активен в определённом узком интервале pH, называемым оптимумом pH. Оптимумы pH отдельных ферментов различаются. Например, максимальная активность пепсина, катализирующего расщепление белка, наблюдается при pH 1,5–2,0, а аргиназы, которая вызывает расщепление аминокислоты аргинина, – при pH 9,5–9,9. С изменением pH от оптимального значения в кислую или щелочную среду активность фермента снижается вначале медленно, а затем очень быстро, и часто такое инактивирование вскоре приобретает необратимый характер (рис. 3).

Оптимум pH действия большинства ферментов лежит в слабокислой или нейтральной реакции среды.

Таблица 2 – Оптимальные значения pH для некоторых ферментов

Фермент	pH	Фермент	pH
Амилаза из со-	4,9 – 5,2	Катепсин B	4,5 – 5,0
лода
Амилаза слюны	6,8 – 7,0	Папаин	5,0
Липаза	7,0 – 8,5	Уреаза	7,3 – 7,9

11

pH опт

V

pH

V – скорость реакции

Рисунок 3 – Зависимость скорости биохимической реакции от pH среды

Согласно современным представлениям, влияние изменений pH среды на молекулу фермента заключается в воздействии на состояние и степень ионизации кислотных и основных групп (в частности, COOH-группы дикарбоновых аминокислот, SH-группы цистеина, NH2-группы лизина и т.д.). При резких сдвигах от оптимума pH среды ферменты могут подвергаться конформационным изменениям, приводящим к потере активности вследствие денатурации или изменения заряда молекулы фермента. При изменении pH нарушается оптимальное соотношение ионизируемых и не ионизируемых групп (соответствующее наибольшей активности фермента), что сказывается на третичной структуре белка и строении его активного центра. Кроме того, концентрация [H+] оказывает влияние на ионизацию субстрата и ионизацию кофактора, что также влияет на скорость течения реакции.

10 Концентрация фермента

Скорость ферментативных реакций зависит от количества фермента в среде. Когда в среде субстрата достаточно, скорость ферментативной реакции возрастает пропорционально увеличению количества фермента. Графически это выглядит следующим образом (рис. 4.):

V

V- скорость реакции

С- концентрация фермента

С Рисунок 4 – Зависимость скорости реакции от концентрации фермента

Эта зависимость справедлива только в определённых условиях, например, в начальный период ферментативной реакции, т.к. в этот период практически не происходит обратной реакции, а концентрация продукта оказывается недостаточной для обратимости реакции. Именно в этом случае скорость реакции (точнее, начальная скорость реакции) будет пропорциональна концентрации фермента.

12

11 Концентрация субстрата

Скорость ферментативной реакции в сильной степени зависит от концентрации субстрата в среде. При низкой концентрации субстрата скорость реакции возрастает пропорционально его концентрации. Однако по мере увеличения концентрации эта пропорциональность нарушается, скорость реакции растёт всё медленнее. Происходит насыщение фермента субстратом, при этом молекулы фермента находятся в форме ES (полное насыщение), скорость реакции становится максимальной (Vm). Очевидно, что при полунасыщении (т.е. когда половина молекул фермента находится в форме ES) скорость реакции равна ½Vm. В этом заключается ещё одна особенность ферментативных реакций, не свойственная реакциям, протекающим в отсутствии ферментов. Если ещё дальше повышать концентрацию субстрата, то скорость реакции достигнет постоянного уровня, становится постоянной, не зависящей от концентрации субстрата. В этих условиях фактором, лимитирующим скорость ферментативной реакции, становится концентрация фермента в среде.

Изучение влияния концентрации субстрата на скорость ферментативных реакций позволило Л. Михаэлису и Ментен создать основы теории ферментативной кинетики.Они вывели классическое уравнение, описывающее гиперболическую зависимость в координатах V-[S]; при увеличении концентрации субстрата скорость ассиметрически стремится к Vm:

V × [S]

V = Kmm + [S]

Одним из основных выводов этой теории является установление константы Михаэлиса, графическое изображение которой представлено на рис.5. Если скорость реакции при высоких концентрациях субстрата достигает некоторой максимальной величины Vm, то концентрация субстрата [S], при которой V=Vm/2, называется константой Михаэлиса Km, т.е. Km=[S]. Таким образом, константа Михаэлиса равна концентрации субстрата (моль/л), при которой скорость ферментативной реакции составляет половину от максимальной.

Более низкие значения Km означают, что ферментативный катализ происходит более интенсивно.

V

Vm/2 Vm

S

V – скорость реакции

Km – концентрация субстрата,

Рисунок 5– Графическое изображение константы Михаэлиса

13

Таблица 3 – Значение констант Михаэлиса – Ментен (Кm) для катализа ферментом гексокиназой фосфорилирования сахаров.

Субстрат

Кm,

Субстрат

Кm,

Субстрат

Кm,

моль/л

моль/л

моль/л

Глюкоза

8×10-6

Аллоза

8×10-3

Манноза

8,5×10-6

H C

O

H C

O

H C

O

H

OH

H

OH

HO

H

HO

H

H

OH

HO

H

H

OH

H

OH

H

OH

H

OH

H

OH

H

OH

H2C

OH

H2C

OH

H2C

OH

Как следует из данных таблицы 5, количество глюкозы, необходимое для 50%-го насыщения фермента, в тысячу раз меньше, чем необходимое для 50%-го аллозой. Следовательно, фермент предпочтительнее взаимодействует с глюкозой

– он более специфичен к ней (реакция протекает тем быстрее, чем ниже Кm). Кm для маннозы практически равен Кm для глюкозы. Сравнивая структуру субстратов, можно видеть, что отличие аллозы от глюкозы и маннозы, так существенно сказавшееся на величине Кm, и, следовательно, скорости реакции фосфорилирования, обусловлено пространственной ориентацией ОН-группы у третьего (сверху) атома углерода и активного центра фермента, по которому идет образование фермен- т-субстратного комплекса.

12 Активаторы и ингибиторы ферментов

Активаторами называют вещества, которые повышают активность ферментов. Примером таких соединений являются аминокислота цистин и восстановленный глютатион, содержащие свободную –SH-группу. Их активирующее действие заключается в том, что они восстанавливают дисульфидные связи с образованием –SH-групп, необходимых для проявления каталитической активности тиоловых ферментов. Кроме того, некоторые ферменты активируются металлами, которые либо участвуют в построении активного центра, либо стабилизируют пространственную конформацию ферментного белка и тем самым обеспечивают проявление каталитических функций. Активность фермента α-амилазы слюны человека повышается в присутствии анионов Clˉ.

Ингибиторы замедляют скорость биохимических реакций, а в ряде случаев полностью приостанавливают её. Процесс ингибирования может быть обратимым и необратимым. При необратимом ингибировании ингибитор ковалентно связывается с ферментом, необратимо изменяя его нативную конформацию. После удаления ингибитора активность фермента не восстанавливается.

Одним из широко известных типов необратимого ингибирования является действие алкилирующих агентов, образующих прочные ковалентные связи с –SH-

14

группами фермента. Необратимыми ингибиторами также являются цианиды, подавляющие активность ферментов цитохромов, содержащих железо; этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), подавляющий действие α-амилазы, за счёт связывания с ионами Ca+2 (кофактора α-амилазы).

При обратимом ингибировании активность фермента восстанавливается после удаления ингибитора. Обратимые ингибиторы бывают конкурентного, неконкурентного, бесконкурентного и смешанного действия.

Первая группа – это близкие аналоги субстратов, содержащие весь набор или, по крайней мере, большую часть групп, узнаваемых активным центром фермента, и поэтому образующие комплекс фермент-ингибитор, сходный с комплексом фермент-субстрат. Однако в силу специфики своей структуры они не подвергаются ферментативному превращению. Занимая активный центр, эти ингибиторы препятствуют связыванию субстрата и тем самым протеканию ферментативной реакции. Они фактически конкурируют с субстратом за взаимодействие с активным центром и поэтому их называют конкурентными ингибиторами. Например, структурные аналоги янтарной кислоты – щавелевая, малоновая, щавеле- во-уксусная – являются конкурентными ингибиторами фермента сукцинатдегидрогеназы, катализирующей окисление янтарной кислоты в фумаровую:

COOH		COOH		COOH		COOH
	CH2		COOH			C				O
					CH2
	CH					CH2
	2				COOH			COOH
	COOH
Янтарная		Щавелевая		Малоновая		Щавелево-
кислота		кислота		кислота		уксусная кислота

Конкурентное ингибирование может быть снято при увеличении концентрации субстрата.

Неконкурентное ингибирование отличается от конкурентного тем, что оно не может быть снято увеличением концентрации субстрата. Неконкурентный ингибитор подавляет каталитическое превращение субстрата в продукты реакции. Полагают, что при неконкурентном ингибировании ингибитор связывается с функционально важной группой фермента, не препятствуя связыванию субстрата, при этом деформируется активный центр, что приводит к нарушению комплементарности к субстрату и снижению активности фермента.

Бесконкурентное ингибирование наблюдается в том случае, когда ингибитор связывается с фермент-субстратным комплексом ES, переводя его в неактивную форму.

При смешанном ингибировании ингибитор действует как на участок связывания, так и на каталитический центр фермента.

15