Глава 3. Эритроциты

3.1. Введение в эритроциты*

3.1.1. Морфология

Обычно человеческие эритроциты имеют диаметр от 6.6 до 7.5 мкм, но также наблюдаются клетки с диаметром больше 9 мкм (макроциты) и меньше 6 мкм (микроциты). Зрелые эритроциты состоят из гемоглобина (~32%), воды (~65%) и мембранных компонентов (3%) и не имеют ядра [202]. Они мягкие, гибкие и эластичные, поэтому легко продвигаются через узкие кровеносные капилляры. Основная функция этих клеток – переносить кислород от лёгких по всему организму и углекислый газ обратно в лёгкие [203].

Зрелый эритроцит может быть описан как однородный двояковогнутый диск, для описания формы которого существует несколько параметрических моделей [204-208]. Наиболее реалистичная форма была предложена Эвансом и Фангом (Fung) [208] на основе прямых экспериментальных измерений:

z(ρ)= ±0.5 1−(2ρ D)2 (C0 +C2 (2ρ D)2 +C4 (2ρ D)4 ),

(173)

где z и ρ это цилиндрические координаты, ось z совпадает с осью симметрии клетки, а D – диаметр эритроцита. Авторы привели параметры для среднего эритроцита одного человека: C0 = 0.81 мкм, C2 = 7.83 мкм, C4 = −4.39 мкм. Эти значения и формула (173) являются основой модели формы эритроцита, используемой в разделе 3.2.

В результате последующего более подробного экспериментального исследования 14-и здоровых людей [209] были полученный статистические данные о следующих параметрах эритроцита: D, минимальная (b) и максимальная (h) толщина, объём V, площадь поверхности S (см. таблицу 12). Хотя авторы не привели значения параметров в формуле (173), соответствующие среднему по всей выборке эритроциту, их можно легко получить, используя известный D и подгоняя формулу (173) до согласия с b, h, V

и S. Эта процедура приводит к следующим значениям: C0 = 1.43 мкм, C2 = 7.92 мкм,

C4 = −5.92 мкм. Формула (173) с этими параметрами используется в качестве эталона для новой четырёхпараметрической модели формы, предложенной в разделе 3.3.

В таблице 12 собраны литературные данные по геометрическим параметрам эритроцитов [208-219]. Они были получены различными методами: световой

* Часть этого раздела опубликова в Tarasov P.A., Yurkin M.A., Avrorov P.A., Semyanov K.A., Hoekstra A.G., Maltsev V.P. Optics of erythrocytes. // Optics of Biological Particles., Hoekstra A.G., Maltsev V.P., Videen G., eds. – London: Springer , 2006 – P.231-246.

139

Таблица 12. Литературные данные по нормальным человеческим эритроцитам.a

Источник	D, мкм	b, мкм	h, мкм	V, мкм3	S, мкм2	ИС	HbC, г/дл
Кенхем и др.	8.07 ± 1.1			108 ± 33	138 ± 35	0.692
(1968) [210]
Чин и др.	8.4			90	152	0.512
(1971) [211]	7.82 ± 1.24b	0.81 ± 0.7b	2.58 ± 0.54b	94 ± 28b	135 ± 32b	0.639b
Эванс и др.
(1972) [208]
Фанг и др.	7.65 ± 1.34	1.44 ± 0.94	2.84 ± 0.92	98 ± 32	130 ± 32	0.704 ±
(1981) [209]						0.21
Ришиери и др.				[86–92]	[123–136]
(1985) [212]
Тико и др.				[83–98]			[32–34.8]
(1985) [213]
Гольдберг	7.46 ± 2.46
(1989) [214]	[7.5–8.3]b
Линдеркамп				[86–95]	[130–144]	[0.579–
(1993) [215]				[91–105]b	[132–147]b	0.625]b
Енгстром и др.
(1994) [216]
Делано				[77–103]	[120–148]	0.613 ±	33.8
(1995) [217]						0.178
ван Хове и др.				90 ± 24			[31.3–36]
(2000) [218]				[81–97]b
Тарасов и др.				87 ± 20b	134 ± 28b		33.3 ± 4.2b
(2006) [219]

aВ ячейках приводится либо среднее значение ± 2×СО (стандартных отклонения), если известно, либо 95% доверительный интервал.

bЭтот интервал получен для одного человека.

микроскопией [210,211,214], интерференционной голографией [208,209], резистивной импульсной спектроскопией [212], светорассеянием сферизованными эритроцитами [213,219], втягиванием в микропипетку [215-217] и несколькими коммерческими проточными цитометрами [218]. В таблице также приведены значения индекса сферичности (ИС) и концентрации гемоглобина (HbC). ИС это производный параметр, определяемы как отношение объёма клетки и шара с той же площадью поверхности,

т.е. ИС = 6 π V S 32 . HbC определяет показатель преломления эритроцита [220]:

′	′′	−4	,	(174)
mer − m0	=ψ ×HbC , mer ~ 10

где m0 это показатель преломления внешней среды, а ψ – удельный показатель преломления гемоглобина, равный 0.0019 дл/г в диапазоне длин волн 0.5–1.2 мкм. Формула (174) согласуется с результатами Стрейкстры (Streekstra) и др. [221] в физиологическом диапазоне HbC. Все эксперименты с клетками, описанные в этой диссертации, были проведены в забуференном физиологическом растворе (0.01 M буфер HEPES, Sigma, pH 7.4 в 0.15 M NaCl), показатель преломления которого равен m0 = 1.337. При этом относительный показатель преломления эритроцита равен

mer m0 =1+ (0.00142 дл г) ×HbC +8×10−5 i .

(175)

140

3.1.2. Светорассеяние эритроцитами

Светорассеивающие свойства крови определяются эритроцитами, так как они составляют её дисперсную фазу. Более того объём и HbC эритроцитов являются важными параметрами в клиническом гематологическом анализе. Также эритроциты играют важную роль в проверке методов моделирования светорассеяния несферическими частицами из-за своей простой внутренней структуры и стабильной формы в виде двояковогнутого диска. Тем не менее большой размерный параметр эритроцитов (примерно 40) способствует поиску приближённых методов моделирования и/или упрощений формы. В частности, эритроциты рассматривались как диэлектрические шары [213,222], сфероиды [223] и эллипсоиды [221,224] с тем же объёмом. Эти предположения оправданы только при специальных экспериментальных условиях, таких как: сферизация с сохранением объёма, осмотическое набухание и деформация в сдвиговом потоке. Различные приближённые теории: АД и дифракция Фраунгофера [221], ВКБ [225] и ГО [224] имеют определённое применение только для изучения некоторых общих свойств или особенностей в индикатрисе одиночных эритроцитов. Из-за присущей им неточности их нельзя применить для решения обратной задачи светорассеяния, чтобы характеризовать эритроциты по индикатрисам.

Цинополос (Tsinopoulos) и Полизос (Polyzos) [226] первые строго моделировали светорассеяние реалистичным недеформированным эритроцитом. Они использовали метод граничных элементов в комбинации с алгоритмом на основе БПФ, позже он был применён к агрегатам эритроцитов [227]. Другим методом, использующим осесимметричность эритроцита, является МДИ, использованный Ерёминой и др. [228], которые сравнивали реалистичные формы со сфероидами и шаровыми дисками (шар, обрезанный двумя параллельными плоскостями). Сравнивая индикатрисы двояковогнутых дисков и приближённых форм, авторы определили ограничения в применении приближённых форм для описания светорассеяния эритроцитами:

1)Приближение эритроцита шаром того же объёма неудовлетворительно.

2)Приближение эритроцита сплюснутым сфероидом того же диаметра и объёма удовлетворительно только в случае ориентации осью симметрии вдоль излучения. Оно даже точно при рассмотрении рассеяния в направлении вперёд: θ ≤ 4°.

3)Мембрана не оказывает заметного влияния на светорассеяние эритроцитом.

4)Модель шарового диска является более точным приближением реальной формы

эритроцита, чем сплюснутый сфероид.

Хотя методы, использующие осесимметричность эритроцита, наиболее быстры, более общие методы, такие как МДД и КРВО, также применялись для моделирования

141

светорассеяния эритроцитами. Карлсон (Karlsson) и др. [229] использовал КРВО, МДД (только для проверки КРВО) и приближённые методы: приближение Рытова и метод суперпозиции, которые хорошо согласуются с КРВО для малых углов рассеяния. Аналогичный анализ был проведён для двух соприкасающихся эритроцитов [194]. Другое исследование светорассеяния эритроцитами с помощью КРВО было проведено Лу (Lu) и др. [230]. Они использовали простую геометрическую параметризацию формы эритроцита [204] и изучали эффекты изменения формы и ориентации эритроцита, а также длины волны падающего света. Более того, они вычисляли светорассеяние эритроцитом, деформированным в потоке крови [196], используя более совершенную параллельную программу на основе КРВО. Авторы привели вычисленные угловые зависимости элементов матрицы Мюллера в зависимости от формы, ориентации и длины волны.

Сравнение результатов разных исследователей затруднено тем, что они используют немного разные модели формы для нативных эритроцитов. Многие [194,226,227,229] используют модель на основе микроскопических измерений Фанга и др. [209] [см. формулу (173)]. Другие – модель Скалака (Skalak) и др. [206] (использовалась Шваловым и др. [225] и Ерёминой и др. [228]), параметрическую модель Борового и др. [204] (использовалась Лу и др. [230]) или поверхность вращения кривой Кассини [207]. Во многих практических приложениях все эти модели приводят к близким удовлетворительных результатам, однако требуется сравнить эти модели для разных размеров и в контексте конкретных применений результатов моделирования.

В классической проточной цитометрии для эритроцитов измеряется рассеяние вперёд и вбок в комбинации с флуоресценцией [231]. Считается, что рассеяние вперёд коррелирует с размером, в то время как основная задача флуоресценции – отделить эритроциты от других клеток. В частности, качественный анализ гистограмм светорассеяния и флуоресценции позволяет получить важную информацию о механизме старении эритроцитов in vivo [232-234]. До последнего времени характеризация популяции эритроцитов (в терминах распределения по объёму и HbC) проводилась сферизацией с сохранением объёма и измерением светорассеяния в два угла [235,236]. Недавно был предложен новый метод для характеризации эритроцитов с помощью СПЦ [219], основанный на эмпирической зависимости между параметрами эритроцита и спектром Фурье его индикатрисы. Объём и HbC определяются сферизацией с сохранением объёма – так же, как в стандартных проточных цитометрах, но более надёжно. А диаметр – непосредственно по индикатрисе нативных эритроцитов.

142