Ориентировочная основа деятельности студентов для проведения лабораторной работы: Определение содержания глюкозы в крови глюкозооксидазным методом

Принцип метода. Ферментативный метод определения глюкозы основан на действии глюкозооксидазы и предназначен для специфического определения глюкозы в биологических жидкостях в присутствии различных сахаров и других редуцирующих веществ неуглеводной природы. Глюкозооксидаза (КФ 1.1.3.4) относится к флавопротеинам (кофермент – ФАД). Глюкоза окисляется при действии фермента с образованием Н₂О₂ и глюконата. Возникшую перекись водорода определяют реакцией, катализируемой ферментом пероксидазой, с последующим окислительным азосочетанием производного фенола с 4-аминофеназоном (хромогенный кислородный акцептор). В ходе реакции образуются окрашенные в розовый цвет продукты. Количественное определение глюкозы заключается в измерении интенсивности окраски красителя и сравнении оптической плотности испытуемой пробы с окраской калибровочного раствора глюкозы.

Порядок выполнения работы:

1). В пробирку №1 (опыт) вносят 0,01 мл сыворотки крови и 1 мл рабочего раствора

(ферментно - хромогенная смесь)

2). В пробирку №2 (контроль) вносят 0,01 мл стандартного раствора глюкозы

(концентрация глюкозы 10 ммоль/л) и 1 мл рабочего раствора

3) Пробирки перемешивают и инкубируют в термостате 30 минут при 37^оС

4) Измеряют оптическую плотность опытной пробы (А_опыта) и контроля (А_{контроля})

на ФЭКе против Н₂О _дистил при длине волны 540 нм

5) Рассчитывают содержание глюкозы по формуле:

Глюкоза (ммоль/л) = (10×А_опыта) : А_{контроля}

В выводах сопоставить величины нормального содержанию глюкозы в крови с данными, полученными в результате проделанной работы.

Клинико-диагностическое значение. Благодаря существованию сложных регуляторных механизмов, концентрация глюкозы в крови сохраняется относительно постоянной – 3.3-5.5 ммоль/л. Концентрация глюкозы в крови зависит от строгой регуляции интенсивности процессов распада и синтеза гликогена, глюконеогенеза, скорости всасывания глюкозы в ЖКТ и окисления ее в тканях с высвобождением энергии.

Гипогликемия – понижение содержания глюкозы в крови. Гипогликемия наблюдается при длительном голодании; сопровождает заболевания поджелудочной железы, опухолевый рост, тяжелые поражения печени, эндокринные нарушения; наблюдается при передозировке инсулина. При гипогликемии ниже 2.7 ммоль/л возникает риск развития гипогликемической комы.

Гипергликемия – повышенное содержание глюкозы в крови (более 6 ммоль/л). Физиологическая гипергликемия наблюдается после приема пищи, при эмоциональном стрессе. Гипергликемия сопровождает эндокринные нарушения (сахарный диабет, гипертиреоз), острый и хронический панкреатиты, заболевания печени, сердечно-сосудистые заболевания и др. При гипергликемии выше 22 ммоль/л развивается гипергликемическая кома.

Глюкозотолерантный тест ( метод «сахарной нагрузки» или построение «сахарных кривых»)

Принцип метода: Глюкозотолерантный тест – оценка углеводного обмена, основанная на определении уровня  глюкозы в крови натощак и после нагрузки. Тест позволяет выявлять скрытые формы сахарного диабета и нарушение толерантности к глюкозе.

Порядок выполнения работы:

1. Первоначально определяют концентрацию глюкозы в крови натощак

Проведение глюкозотолерантного теста возможно только при условии, что результат исследования глюкозы натощак не превышает 6,7 ммоль/л. Подобное ограничение связано с повышением риска возникновения гипергликемической комы при нагрузке.

2. Пациент употребляет около 75 г глюкозы, которая растворена в 200 мл воды (из расчета 1 г/кг массы тела).

3. Через 30, 60, 90 и 120 минут после нагрузки проводят забор крови и определяют концентрацию глюкозы.

4. Результаты определения используются дл построения  гликемических кривых:

У здорово­го человека после приема глюкозы на­блюдается увеличение ее содержания в крови, которое между 30-й и 60-й минутой достигает максимальной ве­личины. Затем начинается снижение и к 120-й минуте содержание глюкозы достигает исходного уровня, отмечавшегося натощак или с небольшими отклонениями в сторону, как повышения, так и снижения. Через 3 ч со­держание сахара в крови достигает исходной цифры. У больных сахарным диабетом отмечается повы­шенный исходный уровень глюкозы и высокая гипергликемия (свыше 8 ммоль/л) уже через час после сахарной нагрузки. Уровень глюкозы остается высоким (свыше 6 ммоль/л) в течение всего второго часа и к концу исследования (через 3 ч) не возвращается к исходному уровню. Одновременно отмечается глюкозурия.

Интерпретация результатов глюкозотолерантного теста:

Время	Концентрация глюкозы в крови
	Толерантность в норме	Толерантность снижена	Сахарный диабет
Натощак	Норма	 6,7 ммоль/л	 6,7 ммоль/л
Через 1 час после нагрузки	Концентрация глюкозы увеличивается на  30-40%	Концентрация глюкозы увеличивается на 80-100%	Концентрация глюкозы увеличивается на 80-100%
Через 2 часа после нагрузки	Концентрация глюкозы приходит в норму	7,8 – 10,0 ммоль/л	 11,1 ммоль/л
Глюкозурия	нет	может быть	есть

Повышение толерантности наблюдается при:

• низкой скорости всасывания глюкозы в ЖКТ, обусловленной его заболеваниями;

• гипотиреозе; гипофункции надпочечников;

• избыточной секреции инсулина поджелудочной железой.

Понижение толерантности наблюдается при:

• неспособности организма утилизировать глюкозу (сахарный диабет);

• тиреотоксикозе; гиперфункции надпочечников (стероидный диабет);

• поражении гипоталамической области;

• беременности;

• общей интоксикации при инфекционных заболеваниях;

• поражении почек.