ВОПРОСЫ ПО ПРАКТИЧЕСКИМ НАВЫКАМ

1.Сущность и техника окраски по Граму.

Окраска по Граму имеет большое значение в систематике бактерий, а также для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний. Кокковые и спороносные формы бактерий, а также дрожжей — грамположительны и окрашиваются в иссиня-черный (темно-синий) цвет, многие неспороносные бактерии — грамотрицательны и окрашиваются в красный цвет, ядра клеток приобретают ярко-красный цвет, цитоплазма — розовый. На мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основным, а другой — дополнительным. Кроме красящих веществ применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.

2. Сущность и техника окраски по Циль-Нильсену. Метод используется для окраски спор и кислотоустойчивых бактерий (микобактерии туберкулеза). Кислотоустойчивость связана с наличием в клеточной стенке мяколовых кислот. Метод Циль-Нильсена основан на использовании концентрированных красителей прогревания.

Методика окраски:

1. На фиксированный мазок накладывают белую фильтровальную бумагу и наливают карболовый фуксин Циля. Препарат 2-3 раза подогревают в пламени до появления паров.	Карболовый фуксин-основная краска; прогревание-протрава.
2. Препарат промывают водой, бумагу сбрасывают.
3. Препарат обесцвечивают в 5% растворе серной кислоты.	Серная кислота-обесцвечивающий фактор.
4. Промывают водой
5. Докрашивают синькой Леффлера 3-5 минут	Синька Леффлера — дополнительная краска
6. Промывают водой, высушивают, смотрят под иммерсией	Кислотоустойчивые бактерии и споры рубиново- красного цвета, а остальная микрофлора — синего цвета

3. Способы выявления оболочки бактерий.

Методы определения строения клеточной стенки.

1. Окраска по Граму. При окрашивании клеток генцианвиолетом (кристаллфиолетовым) и последующем докрашивании раствором люголя (J в KJ), в КС образуется комлпекс пептидогликан+йод+генцианвиолет, который затем обесцвечивают спиртом. У грам отрицательных мо, т.к. у них слой ПГ тонкий весь окрашенный комплекс вымывается из клеточной стенки и они становятся бесцветными. У грам положительных комплекс остается связанным в толстом слое пептидогликана. В итоге после первого окрашивания – грам+ – синие, грам – прозрачные. 2 этап окраски по Граму – этап докрашивания фуксином. После второго этапа грам+ остаются синими, а грам- становятся красными.

2. КОН-тест. В основе метода лежит способность КС грамположительных микроорганизмов сохранять целостность при воздействии гидроокиси калия, тогда как КС грамотрицательных бактерий при этом разрушается. Постановка пробы с КОН предусматривает суспендирование петли суточной агаровой культуры в капле 3% раствора КОН на предметном стекле. При «+» реакции, свойственной грамотрицательным микроорганизмом, жидкость в капле становиться вязко, нити слизи тянутся за петлей на 0,5-2 см. образование слизистой консистенции связывают с выходом из клетки ДНК, являющейся вязким компонентом.

3.В брюшную полость экспериментального животного вводят микроорганизмы, исследуют в процессе фагоцитоза форму мембранной упаковки бактерий, выявляют внеклеточную одномембранную и внутриклеточные одно-, двух- и трехмембранные формы упаковки бактерий. Способ служит основой для разработки новых способов и методов лечебного воздействия на ряд хронических инфекционных заболеваний (туберкулез, лепра и т.д. ). 

4. Сущность и техника окраски по Ожешко.

1. высушенный мазок наливают 0,5 % раствор хлористоводородной кислоты и подогревают 1-2 мин.

2.Препарат промывают водой и фиксируют над пламенем горелки.

3.Окрашивают по способу Циля-Нильсена.

Споры прочно удерживают карболовый фуксин и окрашиваются в красный цвет, цитоплазма бактерий обесцвечивается 5% серной кислотой и после докрашивания метиленовым синим приобретает синий цвет.

5. Сущность, техника обработки препаратов по Морозову.

Тонкий препарат, приготовленный из тканевой жидкости, подлежащей исследованию, высушивают в термостате при температуре 37 °С. На сухой препарат наливают 5—10 капель реактива I, через 1 мин реактив I сливают и препарат промывают дистиллированной водой. На препарат наслаивают реактив II и подогревают на пламени горелки до появления паров, затем тщательно промывают препарат водой и наносят реактив III так, чтобы он покрыл всю поверхность препарата. Предметное стекло вновь подогревают в течение 2— 3 мин до тех пор, пока окраска мазка не станет темнокоричневой. После тщательного промывания дистиллированной водой препарат высушивают и исследуют в микроскопе, пользуясь иммерсионной системой.

Данный метод окрашивания дает импрегнацию серебром бледных трепонем, которые становятся темнокоричневого или почти черного цвета.