6. Люминесцентный метод микроскопии, сущность, возможности, назначение.

Люминесцентная микроскопия — оптическое исследование микрообъектов, окрашенных специальными красителями (флюорохромами), испускающими свечение при воздействии ультрафиолетовыми лучами. Для люминесцентной микроскопии применяются специальные оптические устройства и микроскопы, основной частью которых является источник ультрафиолетовых лучей и система фильтров к нему. Флюорохромы, как правило, флюоресцируют по-разному в зависимости от химического состава структур, с которыми они взаимодействуют. Некоторые из них обладают сродством к определенным клеточным структурам. Например, акридиновый оранжевый краситель окрашивает нуклеопротеиды клетки, аурамин — воскоподобное вещество, содержащееся в микобактериях. Некоторые микрообъекты не требуют предварительной окраски флюорохромами и изучаются с помощью люминесцентной микроскопии без окраски.

7. Как определить характер и глубину углеводного обмена у бактерий.

2. Среды для выявления способности микробов расщеплять углеводы и высокоатомные спирты(Эндо среда, Левина среда, Расселла среда, Дригальского — Конради среда, Рапопорт — Вайнтрауба среда, Шустовой среда).

 обмен у бактерий также носит двоякий характер - это процесс синтеза и распада углеводов. Расщепление углеводов бактериями (сахаролитические свойства) в аэробных условиях с образованием углекислого газа и воды называется горением, а расщепление ими углеводов в анаэробных условиях - брожением. В зависимости от характера конечных продуктов разложения углеводов в анаэробных условиях различают брожение: - спиртовое, - молочнокислое, - пропионовокислое, - муравьинокислое,

- маслянокислое, - уксуснокислое.

В микробиологической практике часто возникает потребность исследовать ферментацию не только одного, а нескольких  сразу. С этой целью используют среды Гисса. Они могут иметь жидкую и полужидкую консистенцию.

Основой жидкой среды является 1 % пептонная вода с 0,5 % натрия хлорид, 1 % углеводов (глюкозы, мальтозы, лактозы, сахарозы, др.). К нему добавляют индикатор Андреде (кислый фуксин в 1 н растворе NаOH). Устанавливают рН 7,2, при нем среда имеет желтый цвет. Среды с разными углеводами разливают в отдельные пробирки, в которые устанавливают поплавок – запаянную из одного конца стеклянную трубочку длиной 3 см открытым концом книзу. Стерилизуют парой под давлением 0,5 атм 15 мин.

После посева бактерий, если они ферментируют углеводы, наблюдают появление красной расцветки, которая свидетельствует об изменении рН в кислую сторону (образование кислоты), а порой из поплавка вытесняется жидкость. Тогда делают вывод об образовании газа. Следовательно, возможны три варианта при учете результатов посева на среде Гисса: микроорганизмы не ферментируют  субстрат (негативный ответ) или бактерии раскладывают углеводы (позитивный ответ) с образованием кислоты без газа или кислоты и газа.

Учитывая, что микроорганизмы по-разному действуют на углеводы (разлагают или не разлагают), при конечном учете результатов наблюдают пробирки с измененным или неизмененным цветом жидкости. Это создает впечатление пестрости, а такой ряд называют пестрым рядом Гисса.

8. Иммунолюминесцентный (прямой) метод диагностики. Достоинства и недостатки. Метод люминесцирующих антител (иммунолюминесцентный) предложен американским исследователем Кунсом в 1942 г. для диагностики болезнетворных микроорганизмов. Данный метод нашел широкое применение в медицинской микробиологии.

В основе метода люминесцирующих антител лежит реакция взаимодействия антигена с антителами, меченными люминесцирующим красителем.

Широко известны два варианта иммунолюминесцентного метода: прямой способ Кунса и непрямой способ Уэллера и Кунса.

Прямой метод заключается в том, что меченную люминесцирующим красителем иммунную сыворотку наносят на мазок с фиксированным антигеном. После окрашивания во влажной камере препарат промывают физиологическим раствором, высушивают и исследуют под люминесцентным микроскопом, выявляя клетки с характерным светящимся ободком.

При непрямой модификации окрашивание проводят в два этапа. Сначала на фиксированный мазок с антигеном наносят гомологичную немеченую сыворотку, полученную путем иммунизации кролика данным видом микроорганизма, но не соединенную с флуорохромом. Затем на промытый и высушенный препарат с нелюминесцирующим комплексом антиген-антитело наслаивают люминесцирующую антисыворотку, содержащую антитела против белков сыворотки кролика (например, ослиную антикроличью). После окрашивания препарат вторично промывают, высушивают и микроскопируют под люминесцентным микроскопом.

Опыт работы показал, что непрямой метод люминесцирующих антител по своей специфичности и чувствительности не уступает прямому методу окраски. В то же время непрямая модификация имеет существенное преимущество перед прямым способом, так как требует лишь одной люминесцирующей сыворотки - анти кроличьей, которая выпускается в готовом виде. Видовые сыворотки при этом не метятся флуоресцеином. Недостатками непрямого метода являются некоторое увеличение продолжительности анализа (на 30-40 мин) по сравнению с прямым методом и появление легкого свечения фона препарата вследствие свечения белков сыворотки, адсорбируемых на предметном стекле.

9. Простые и сложные питательные среды. Подберите примеры, определите назначение. Питательные среды — субстраты, используемые для культивирования в искусственных условиях различных микроорганизмов. В зависимости от свойств, состава и назначения П. с. делят на группы. По консистенции различают питательные среды твердые, полужидкие и жидкие. Примером твердых сред являются 1,5—2% агаровые среды (мясо-пептонный агар, агар Хоттингера), питательная желатина, свернутая сыворотка, свернутый яичный белок, картофель и др. Для приготовления твердых П. с. наиболее часто используют агар-агар, получаемый из морских водорослей. Агар-агар является веществом полисахаридной природы. В воде набухает, образуя студень. Разжижается при t° 70-100° и застывает при 40-50°. Полужидкой средой является 0,5% агар мясо-пептонный (см.). К жидким средам относят бульон мясо-пептонный (см.), пептонную воду, сахарный бульон, бульон Хоттингера, представляющий собой разведенный (в 4—9 раз) мясной фильтрат, подвергшийся ферментативному гидролизу панкреатином и содержащий 0,5—1% поваренной соли.

10. Сущность, техника окраски по Нейссеру. используют для выявления зерен волютина у возбудителей дифтерии и др. коринебактерий. Фиксированный мазок 2 - 3 мин красят уксуснокислым синим, 10 - 30 с обрабатывают р-ром Люголя, слегка промывают водой и докрашивают в течение 30 с р-ром везувина, высушивают и микроскопируют. Бактерии окрашиваются в желтый цвет, волютин -в темно-синий.

11. Элективные питательные среды. Принципы конструирования. термин в микробиологии, которым обозначают специальные питательные среды для выращивания определенных видов микроорганизмов. Это синтетические среды, в которых компоненты подобраны таким образом, что обеспечивают преимущество в развитии определенного вида или группы близких видов микроорганизмов, и неблагоприятные для других видов. Эту среду можно создать, зная физиологические особенности исследуемых группы бактерий. Элективные среды применяют для выделения определенных видов по окружающей среде для исследования в лабораторных условиях (в частности выделение патогенных штаммов в клинических исследованиях). Кроме того в лабораториях и на производстве такие среды позволяют проводить исследования в отношении нестерильных условиях. Питательную среду можно сделать элективной при добавлении в нее определенных антибиотиков, солей, или, например, изменить рН. Таким образом, добавив определенные составляющие, можно способствовать размножению одних микроорганизмов и подавлению других микроорганизмов. Термин был введен Виноградским.

12. Прочитать готовые результаты нарастания титра бактериофага. концентрация бактериофага в единице объема, которая способна лизировать определенное количество бактерий. 1) число активных единиц бактериофага, содержащихся в 1 мл фаголизата; 2) по Аппельману - предельное разведение взвеси бактериофага, способное вызвать лизис культуры чувствительных бактерий в жидкой питательной среде; 3) по Грациа - количество негативных колоний, образовавшихся из определенного объема (обычно 1 мл) взвеси бактериофага (исследуемого материала) при ее культивировании совместно с чувствительными бактериями.

13.Дифференциально-диагностические среды. Принципы конструирования. специальные смеси питательных веществ, применяемые для определения видовой принадлежности микробов и изучения их свойств. При росте бактерий на дифференциально-диагностических средах протекают химические процессы, обусловленные наличием у микробной клетки различных ферментов. Одни из них способны расщеплятьбелки, другие —углеводы, третьи — вызывать реакции окисления и восстановления и т. д. Благодаря действию ферментов в дифференциально-диагностической среде происходят соответствующие изменения.

1. Среды, содержащие белок и выявляющие способность микробов расщеплять белки (протеолитические Свойства): мясо-пептонная желатина«столбиком», свернутая лошадиная или бычья сыворотка, молоко, кровяной агар.

2. Среды для выявления способности микробов расщеплять углеводы и высокоатомные спирты(Эндо среда, Левина среда, Расселла среда, Дригальского — Конради среда, Рапопорт — Вайнтрауба среда, Шустовой среда).

3. Среды, на которых выявляется способность микробов обесцвечивать красители, добавленные к бульону: метиленовый синий, тионин, лакмус, индигокармин, нейтральный красный или другие (среда Ротбергера, среда Омелянского).

4. Среды, выявляющие способность микробов усваивать вещества, которые не усваиваются другими микробами, например среда с лимоннокислым натрием (цитратный агар Симонса) для отличия кишечной палочки, которая лишена способности ассимилировать эту среду, от других бактерий кишечной группы или среда с олеиновокислым натрием для дифференциации дифтерийной палочки от ложно дифтерийной и дифтероидов (агар Энжеринга).