5.Световая микроскопия, разновидности.

Определяется апертурой- действием отверстий оптической системы.

Длиной световой волны

1.Световое поле в проходящем свете(для изучения прозрачных объектов)

2. Световое поле в отр. свете(для непрозрачных объектов)

3. Метод косого освещения (по углом, следовательно виден рельеф)

4. Тёмное поле (лучи мимо линзы объекта, поле тёмное, соответственно объект виден в рассеянном свете)

5. Метод фазового контраста (для того, чтобы рассмотреть то, что совпадает с опр. средой, но все-таки отличается; разная плотность даёт смещение фаз луча, следовательно и изображение)

6. Люминесцентная микроскопия (сначала поглощают свет, затем испускают)

7. Интерференционная микроскопия (для изучения неокраш. непрозр. объектов)

8. Поляризационная микроскопия (для изучения структур с упорядочен.строением)

6.Витальные методы.

Прижизненное изучение клетки. В качестве объектов можно использовать свободноживущие клетки простейших и других одноклеточных организмов, клетки крови или же разобщенные тканевые клетки многоклеточных организмов, как животного, так и растительного происхождения. Для кратковременного наблюдения клетки помещают просто в жидкую среду на предметное стекло; если нужно длительное наблюдение за клетками, то используются специальные камеры. В любом из этих случаев клетки изучают в специально подобранных средах. Свободноживущие одноклеточные организмы рассматривают и изучают в тех же средах, в которых они живут в естественных условиях или культивируются в лаборатории. Обычно это сбалансированные солевые растворы с добавками микроорганизмов или других простейших, служащих пищей для данного вида организма. Клетки крови или другие свободные клетки многоклеточных могут изучаться в капле плазмы. Можно производить микрохирургические операции. Получение эмбрионов, слияние соматических клеток. В случае окраски: 1. Краситель вводят в организм с избирательной окраской. 2. Клетки выделяются, далее окрашиваются. Красители бывают: кислые, основные, нейтральные.

7.Изучение фиксированных клеток.

Для фиксации клеток используются альдегиды и их смеси с другими веществами. В качестве фиксаторов применяют также спирты, вызывающие необратимую денатурацию белков, осаждение нуклеиновых кислот и полисахаридов. 1. Формалин. 2. Спирт 3. Сулемой 4. Осмием 5. Замораживание 6. Леофилизация – замораживание и высушивание

После фиксации материал подвергают дополнительной. Приготовление постоянных микропрепаратов: 1. Фиксация объекта 2. Промывание водой 3. В 70градусный спирт 4. Окрашивание 5. Обезвоживание 6. На предметное стекло 7. Накрывают стекло.

Изготовление срезов: 1. Фиксация 2. Промывание водой 3. Обезвоживание 4. Просветление 5. Уплотнение 6. Делают срез 7. Удаление уплотнителя 8. Промывание 9. Окрашивание 10. Промывание 11. Обезвоживание 12. Заключение в канадский бальзам.

Изучение фиксированных препаратов бывает с помощью: 1. цитохимического метода (изучение химического состава клеток и тканей) 2. Ультро-химическое изучение(изучается всё в очень маленьких дозах) 3. Рентгеноструктурный анализ 4. Иммунно-химические реакции (использование светящихся антител) 5. Радиоавтография (использование радиоактивных изотопов) 6. Количественные методы цитологии – цитофотометрия (количество вещества по количеству поглощённых веществ).

8. Цитохимические методы.

Цитохимические методы исследования – микроскопические методы исследования, позволяющие проводить анализ химического состава клетки и локализации в ней исследуемых веществ при сохранении структуры клетки. Эти методы помогают определять характер, интенсивность обмена веществ в клетке, а также изучать различные специализированные функции клетки. В отличие от гистохимических методов цитохимические методы исследования применяют для анализа только отдельных клеток или их групп, причем цитохимические методы обладают большей чувствительностью. От биохимических методов исследования цитохимические отличает возможность точно определить локализацию исследуемых веществ в клетке.

Методы исследования химического состава клетки подразделяют на физические (интерференционная, флуоресцентная и УФ-микроскопия) и собственно химические. Последние должны обеспечивать специфичность связывания красителя исследуемым веществом, сохранение неизменной локализации вещества в клетке в процессе подготовки и проведения исследования, окраску конечного продукта химические реакции, сохранность структур клетки в условиях её осуществления. Белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и липиды в клеточных структурах выявляют с помощью красителей (хромогенные агенты), избирательно связывающихся со специфическими группами этих веществ. Для повышения специфичности реакций применяют экстрагирование, блокаду или ферментативное расщепление неспецифических компонентов. Сохранение неизменной локализации анализируемого вещества достигается его фиксацией. Для обеспечения сохранности структур клетки в условиях химических реакций используют методы (в том числе методы аналитической химии), не требующие применения концентрированных кислот, щелочей, нагревания до высокой температуры и т. п.

Оценка анализируемых с помощью цитохимических методов исследования веществ может быть качественной и количественной. При качественных методах цитохимического анализа интенсивность реакции и локализация её продукта определяются визуально, с помощью микроскопа. Качественные цитохимические реакции выявляют белки и аминокислоты клетки, различные ферменты, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, пигменты, биогенные амины и неорганические вещества.

Количественные методы цитохимического исследования используют для определения содержания веществ в клетке и её структурах. Наиболее распространённым методом количественного цитохимического исследования является цитофотометрия. Важную роль играет также авторадиография, используемая для анализа скорости синтеза и обмена веществ в клетке, определения локализации отдельных веществ, перемещения их внутри клетки, для выявления клеток, маркированных радиоактивными изотопами и др.

8. Рентгеноструктурный анализ и радиоавтография.

Рентгеноструктурный анализ. Для изучения структуры макромолекул на ато­марном уровне применяют методы с использованием рентгеновских лучей, имеющих длину волны около 0,1 нм (диаметр атома водорода). Молекулы, образующие крис­таллическую решетку, изучают с помощью дифракционных картин, которые регист­рируют на фотопластинке в виде множества пятен различной интенсивности. Интен­сивность пятен зависит от способности различных объектов в решетке рассеивать излучение. Положение пятен в дифракционной картине зависит от положения объек­та в системе, а их интенсивность свидетельствует о его внутренней атомной структуре.

Метод радиоавтографии. Этот метод дает возможность наиболее полно изучить обмен веществ в разных структурах. В основе метода лежит исполь­зование радиоактивных элементов (например, фосфора - ³²Р, углерода - ¹⁴С, серы - ³⁵S, водорода - ³Н) или меченных ими соединений. Радиоак­тивные вещества в гистологических срезах обнаруживают с помощью фото­эмульсии, которую наносят на препарат и затем проявляют. В участках пре­парата, где фотоэмульсия соприкасается с радиоактивным веществом, про­исходит фотореакция, в результате которой образуются засвеченные участ­ки (треки). Этим методом можно определять, например, скорость включе­ния меченых аминокислот в белки, образование нуклеиновых кислот, об­мен йода в клетках щитовидной железы и др.

8. Количественные методы в цитологии.

В настоящее время наряду с качественными методами разработаны и применяются количественные гистохимические методы опре­деления содержания различных веществ в клетках и тканях. Особенность количественно-гистохимических (в отличие от биохимических) методов исследования заключается в возможности изучения концентрации и содер­жания химических компонентов в конкретных структурах клеток и тканей.

Цитоспектрофотометрия - метод количественного изучения внутрикле­точных веществ по их абсорбционным спектрам.

Цитоспектрофлюориметрия - метод количественного изучения внутри­клеточных веществ по спектрам их флюоресценции или по интенсивности флюоресценции на одной заранее выбранной волне (цитофлюориметрия).

Современные микроскопы - цитофлюориметры позволяют обнаружить в различных структурах малые количества вещества (до 10~¹⁴-10~¹⁶ г) и оце­нить локализацию исследуемых веществ в микроструктурах.

Интерферометрия. Этот метод позволяет оценить сухую массу и концен­трацию плотных веществ в живой и фиксированной клетках. С помощью этого метода, например, можно установить суммарное содержание белков в живых и фиксированных клетках.

8. Методы изучения физико-химических свойств клетки.

О вязкости клеточного содержимого, которое дает представление об агрегатном состоянии цитоплазмы и ядра, можно судить по скорости падения зерен крахмала в цитоплазме некоторых растительных клеток, по скорости перемещения ядрышка под влиянием силы тяжести, по скорости перемещения капельки масла, введенной в нервное или мышечное волокно, по скорости перемещения металлической частицы, введенной в клетку в магнитном поле, и по броуновскому движению, обычно наблюдаемому во многих растительных и животных клетках.

Измерение удельного веса клетки осуществляется путем подбора жидкости, не оказывающей токсического действия и с удельным весом, равным таковому клетки. Для этой цели пригодны, например, растворы гуммиарабика различной концентрации. Клетки помещаются в такую жидкость и центрифугируются. Удельный вес клеток и жидкости совпадает тогда, когда клетки не перемещаются при центрифугировании в этой жидкости. Таким же способом измеряется удельный вес изолированных ядер и органоидов клетки.

Определение показателя преломления клеток производится путем погружения клеток в индифферентные жидкости, обладающие разными показателями преломления. Когда показатели преломления клеток и среды совпадают, контуры клетки становятся невидимыми при наблюдении в фазово-контрастный микроскоп. Второй метод измерения показателя преломления основан на наблюдении клеток в интерференционном микроскопе. При этом по специальным формулам вычисляется отставание по фазе световой волны, прошедшей через клетку, по сравнению со световой волной, прошедшей вне клетки.

Определение внутриклеточного рН можно произвести путем прижизненного окрашивания клеток красителями, обладающими свойствами индикаторов (нейтральный красный, бромкрезиловый синий). В крупных клетках, например в гигантском нервном волокне, мышечном волокне, в крупных растительных клетках, рН определяется электрометрическим методом с применением микроэлектродов.

К этой же группе методов относится измерение электрического заряда поверхности клетки, измерение поверхностного натяжения и изоэлектрической точки клеток и др. Важно, чтобы определение всех перечисленных физико-химических свойств проводилось на живых, неповрежденных клетках.

8. Изучение изолированных клеточных структур.

Современные методы исследований позволяют проводить анализ хими­ческого состава различных структурных компонентов клеток, как фиксиро­ванных, так и живых. Изучение отдельных внутриклеточных структур стало возможным после разработки технологий фракционирования клеточного содержимого.

Фракционировать структуры и макромолекулы клеток можно различны­ми методами - ультрацентрифугированием, хроматографией, электрофо­резом. Подробнее эти методы описаны в учебниках биохимии.

Ультрацентрифугирование. С помощью этого метода клетки можно разделить на органеллы и макромолекулы. Вначале разрушают клет­ки осмотическим шоком, ультразвуком или механическим воздействием. При этом мембраны (плазмолемма, эндоплазматический ретикулум) распадаются на фрагменты, из которых формируются мельчайшие пу­зырьки, а ядра и органеллы (митохондрии, аппарат Гольджи, лизосомы и пероксисомы) сохраняются интактными и находятся в образующей сус­пензии.

Для разделения вышеуказанных компонентов клетки применяют высо­коскоростную центрифугу (80 000-150 000 оборотов/мин). Вначале оседают (седиментируют) на дне пробирки более крупные части (ядра, цитоскелет). При дальнейшем увеличении скоростей центрифугирования надосадочных фракций последовательно оседают более мелкие частицы - сначала мито­хондрии, лизосомы и пероксисомы, затем микросомы и мельчайшие пу­зырьки и, наконец, рибосомы и крупные макромолекулы. При центрифу­гировании различные фракции оседают с различной скоростью, образуя в пробирке отдельные полосы, которые можно выделить и исследовать. Фрак­ционированные клеточные экстракты (бесклеточные системы) широко ис­пользуют для изучения внутриклеточных процессов, например для изуче­ния биосинтеза белка, расшифровки генетического кода и др.

8. Химические злементы клетки.

Выделяют 86 химических элементов. 25 – элементы жизни, из них 18 – необходимы абсолютно, 7 – полезны. Делятся на группы: макроэлементы (98% от массы клетки) О, С, Н, N; микроэлементы (1,9%) S, P, Cl, K,Na, Mg, Ca, Fe; ультрамикроэлементы (0,1%) Zn, Cu, I, F. Вода 75-80%, белки 10-20%, жиры 1-5%, углеводы 0,2-2%, нуклеиновые кислоты 1-2%, неорганические вещества 1-1,5%, АТФ.

8. Неорганические вещества клетки.

Вода и минеральные вещества.

Вода в клетке существует в двух формах. Связанная (4-5%) – связана с белками, не растворяет солей, замерзает при -40. Свободная – учавствует в реакциях. Значение воды: теплоемкость, теплопроводность, растворитель, транспорт веществ, гидрофильные/гидрофобные свойства веществ, участие в химических реакциях (гидролиз), источник водорода при фотосинтезе у эукариот, влияет на активность ферментов, влияет на организацию белковых молекул.

Минеральные вещества. Все неорганические вещества клетки играют собственную, важную роль. Так, азот участвует в великом множестве соединений - как белковых, так и небелковых, способствует образованию витаминов, аминокислот, пигментов. Кальций представляет собой антагонист калия, служит клеем для растительных клеток. Молибден улучшает устойчивость растений против грибков-паразитов, способствует ускорению синтеза белка. Железо участвует в процессе дыхания, входит в состав молекул гемоглобина. Медь отвечает за образование клеток крови, здоровье сердца и хороший аппетит. Бор отвечает за процесс роста, в особенности у растений. Калий обеспечивает коллоидные свойства цитоплазмы, образование белков и нормальную работу сердца. Натрий также обеспечивает правильный ритм сердечной деятельности. Сера участвует в образовании некоторых аминокислот. Фосфор участвует в образовании огромного количества незаменимых соединений, таких, как нуклеотиды, некоторые ферменты, АМФ, АТФ, АДФ.

Существуют в твердом виде (раковины моллюсков), в растворенном (K,Na,Ca– работа нервной системы, анионы фосфорной и угольной кислот влияют на буферность клетки/кислотность)

8. Строение и функции белков.

Белки занимают 1 место среди органики, имеют огромный молекулярный вес. В пределах одного организма имеется большое количество разнообразия белков. 20 аминокислот в составе.

Схема аминокислоты:

Между двумя аминокислотами образуется пептидная связь (ковалентная). Белковая молекула имеет 4 уровня организации

Первичная структура. Цепочка аминокислот. Свойства ее зависят от количества, порядка, набора аминокислот.

Вторичная стуктура. Поддерживается водородными связями. Характерна для белков с механической прочностью (коллаген)

Третичная структура. Глобула, формируются дисульфидные связи (S-S). Антитела, ферменты, гормоны

Четвертичная структура. Несколько глобул (гемоглобин)

Для белков характерны:

Денатурация – теряют свои уровни организации

Ренатурация – если только не разрушена первичная структура.

Функции белков:

Строительная (в составе всех клеточных мембран)

Каталитическая

Двигательная (актин, миозин)

Транспортная (гемоглобин, гинеин)

Защитная (антитела лейкоцитов)

Энергетическая

Запасающая

Токсины