Практична робота

Дослід 1. Кількісне визначення гідроксипроліну (оксипроліну) в сечі.

Принцип методу. Метод базується на окисненні гідроксипроліну до сполуки, близької за будовою до піролу, яка при конденсації з реактивом Ерліха (п-диметиламінобензальдегід) дає рожеве забарвлення. Інтенсивність забарвлення розчину пропорційна концентрації гідроксипроліну.

Матеріальне забезпечення: реактив Ерліха, 3 н розчин сульфатної кислоти, 6% розчин водню пероксиду, 2,5 н розчин натрію гідроксиду, 0,01 М розчин міді сульфату, водяна баня, ФЕК, мірні піпетки, пробірки, лійка, фільтрувальний папір.

Хід роботи: У першу пробірку відмірюють 1мл профільтрованої сечі, в другу – 1мл дистильованої води (контрольна проба). В обидві пробірки додають по 1мл 0,01 М розчину міді сульфату, по 1 мл 2,5 н розчину натрію гідроксиду, по 1мл 6% розчину водню пероксиду. Проби перемішують 5 хв, після чого нагрівають 3 хв у киплячій водяній бані, а потім пробірки охолоджують водою з крану. У пробірки додають по 4мл 3 н розчину сірчаної кислоти і по 1мл реактиву Ерліха, ставлять на 1 хв у киплячу водяну баню, охолоджують, а потім вимірюють оптичну густину на ФЕКу проти контролю при довжині хвилі 500 – 560 нм (зелений світлофільтр) у кюветі завтовшки 10 мм.

За калібрувальним графіком визначають вміст гідроксипроліну в дослідній пробі і розраховують кількість гідроксипроліну, виділеного з сечею впродовж доби за формулою:

,

де а – кількість гідроксипроліну, знайдена за калібрувальним графіком; V доб. – добовий об’єм сечі мл; V проби – об’єм сечі, взятий для аналізу, мл.

Крива залежності оптичної густини розчину гідроксипроліну від його концентрації

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок

Клініко-діагностичне значення. Гідроксипролін – це амінокислота, яка характерна для білків сполучної тканини – колагену (містить 12-14 %) і еластину (1-2 %). Саме вміст гідроксипроліну в сечі та крові характеризує інтенсивність катаболізму колагену та швидкість обміну цієї амінокислоти. Гідроксипролін може знаходитись у стані, зв’язаному з білками, пептидами, а також у вільному стані як у сироватці крові, так і в сечі. У віці людини 10 – 20 років з сечею виділяється до 200 мг гідроксипроліну за добу, а у дорослих – 15-50 мг. Зростання цього показника спостерігають при колагенозах (ревматизм, ревматоїдний артрит, системна склеродермія, дерматоміозит), при гіперпаратиреоїдизмі, хворобі Педжета (до 1 г за добу). Ще більше виділяється гідроксипроліну при спадковій гіпергідроксипролінемії, що спричинено дефектом ферменту гідроксипролін-оксидази, в результаті чого порушується обмін гідроксипроліну.

Дослід 2. Якісна реакція на глікозаміноглікани (проба Беррі-Спінанджера).

Принцип методу. При взаємодії глікозаміногліканів з толуїдиновим синім у кислому середовищі утворюється червоне забарвлення (метахромазія).

Матеріальне забезпечення: толуїдиновий синій (0,04 %-ий розчин в ацетоацетатному буфері з рН 2,0), 10 %-ий розчин ацетатної кислоти, фільтрувальний папір, мікропіпетки.

Хід роботи: На смужку фільтрувального паперу на віддалі 1 см один від одного наносять мікропіпеткою 0,005, 0,01 і 0,025 мл сечі, висушують папір при кімнатній температурі, а потім занурюють його в 0,04 %-ий розчин толуїдинового синього на 1 хв. Виймають смужку паперу і відмивають реактив 10 % розчином ацетатної кислоти. Якщо концентрація глікозаміногліканів в досліджуваній сечі перевищує 10 мг/100 мл, тоді з’являється червоне забарвлення на одній із нанесених плям.

Зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. У сечі здорової людини міститься 2,7 – 7,5 мг/добу кислих глікозамінгліканів (в основному хондроїтинсульфати А і С). Негативну реакцію спостерігають у здорової дитини вже на 2-ий тиждень життя. При гаргоїлизмі і синдромі Гунтера суттєво підвищується виділення глікозаміногліканів з сечею (мукополісахаридурія) до 30 – 80 мг/добу.

контроль виконання лабораторної роботи

1. У крові та сечі жінки віком 63 роки, яка хворіє на ревматизм, підвищена концентрація оксипроліну. Що є основною причиною гіпероксипролінемії?

А. Активація пролілгідроксилази

В. Деградація колагену

С. Порушення функції нирок

D. Активація катепсинів

Е. Деградація гіалуропротеїну

2. До фібрилярний елементів сполучної тканини належать колаген, еластин та ретикулін. Вкажіть амінокислоту, яка входить тільки до складу колагену, і визначення якої в біологічних рідинах використовується для діагностики захворювань сполучної тканини?

A. Гідроксипролін

B. Гліцин

C. Фенілаланін

D. Пролін

E. Лізин

3. Пацієнт обстежується в клініці з приводу підозри на колагеноз. Цю патологію можна підтвердити за умови збільшення в крові:

A. Вмісту оксипроліну та оксилізину

B. Активності ізоферментів ЛДГ

C. Вмісту креатину та креатиніну

D. Вмісту уратів

E. Активності трансаміназ

4. У хворих на колагеноз спостерігається деструкція сполучної тканини. Які дослідження лабораторних показників крові та сечі доцільно призначити хворому з підозрою на наявність колагенозу (хронічна форма)?

A. Активності трансаміназ крові

B. Активності ізоензимів ЛДГ крові

C. Вміст уратів в крові

D. С-реактивного білка в крові

E. Вмісту оксипроліну та оксилізину в крові та сечі

5. Деякі патогенні мікроорганізми здатні руйнувати гіалуронову кислоту, виділяючи ензим гіалуронідазу. У чому полягає їх перевага перед мікробами, які не виявляють гіалуронідазної активності?

6. Пацієнт з опіковою хворобою перебуває під загрозою утворення тромбів у кровоносних судинах через посилення згортання крові. Який глікозаміноглікан можна використати, щоб запобігти утворенню тромбів?

7. У хворого виявлена крихкість стінок кровоносних судин, підвищена кровоточивість, знижена міцність і еластичність шкіри, хитаються і випадають зуби. Нестача якого вітаміну може призвести до цих порушень? У біосинтезі якого компонента сполучної тканини він бере участь? Як називається такий стан?

8. При старінні організму шкіра зморщується, зростає її сухість, послаблюється екскреція гідроксипроліну з сечею. Які основні біохімічні зміни відбуваються при цьому.