УО "МИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ КОЛЛЕДЖ"
Методическая разработка практического занятия для учащихся отделения «Медико-диагностическое дело» по дисциплине
«Микробиология с микробиологическими исследованиями».
Практическая работа №53
Тема занятия: «Микробиологическая диагностика чумы»
Составила преподаватель: Якимова Л.М.
Минск 2009г
Практическая работа №53
Тема: Микробиологическая диагностика чумы.
Цель занятия: - ознакомить учащихся с правилами работы в лаборатории ООИ и методами микробиологической диагностики чумы.
I. Самостоятельная работа.
-
Знакомство с правилами внутреннего распорядка в лаборатории ООИ
-
Изучение памятки по одеванию и снятию противочумного костюма.
-
Изучение схемы микробиологической диагностики чумы
-
Изучение морфологии возбудителя чумы, микроскопия музейных препаратов
II. Методические указания к практической работе.
Материалом для исследования от людей с подозрением на чуму может быть содержимое бубона или его отделяемое (бубонная форма чумы), содержимое язвы и других кожных поражений (кожная форма), кровь, моча (все формы чумы, особенно септическая), фекалии, спинномозговая жидкость (в случаях поражения кишечника или мозговых оболочек), мокрота, слизистое отделяемое зева (лёгочная форма чумы), секционный материал (кусочки селезёнки, печени, лёгкого, лимфатические узлы, кровь, костный мозг).
При проведении эпизоотологического обследования лабораторному исследованию подвергают грызунов (диких и синантропных), трупы грызунов, блох грызунов и жилища человека, клещей и других эктопаразитов. Реже исследуют других млекопитающих (диких и домашних животных) и членистоногих.
Исследованию подлежат объекты внешней среды (воздух палат госпиталей для больных лёгочной формой чумы, почва нор грызунов и другие). При транспортировке в стационарные бактериологические лаборатории материал помещают в специальные термостаты с сухим льдом или походные холодильники. Для пересылки материала на далёкие расстояния в жаркое время рекомендуется пользоваться консервантами. Исследование на чуму начинается одновременно бактериологическим, биологическим и серологическим методами. Бактериоскопический метод.
При исследовании материала от больного человека каплю пунктата из плотных частей карбункула (бубона) наносят на предметное стекло и растирают платиновой петлёй осторожно, не допуская разбрызгивания. Обычно на одном предметном стекле делают отпечатки из всех органов, располагая их поперёк длины стекла в следующем порядке: из лимфоузла наносят на стекло 4 отпечатка, селезёнки-3, лёгкое-2, печень-1, крови-длинный мазок поперёк стекла. Приготовленные мазки высушивают на воздухе, после чего фиксирует погружением в 96° этиловый спирт на 20 мин с последующим сжиганием спирта на стекле или смесью Никифорова. Мазки, подлежащие исследованию люминесцентным методом, фиксируют в чистом этиловом спирте без последующего обжигания. При обнаружении первых случаев заболеваний, подозрительных на чуму, или трупа человека готовят не менее 6-8 мазков. Один окрашивают 1% водным раствором метиленовой синьки, второй – по Граму, третий – обрабатывают коммерческим иммуноглобулином диагностическим чумным люминесцирующим. Остальные мазки оставляют неокрашенными для повторных исследований. Наличие в препаратах грамотрицательных овоидных биполярно окрашенных анилиновыми красками палочек или люминесцентный положительный анализ при соответствующих клинических, патологоанатомических, эпидемиологических и эпизоотологических данных дают основание поставить предварительный диагноз чумы.
Бактериологический метод
Производят посев материала на питательные среды: агар Хоттингера или Мартена с сульфитом натрия и генцианвиолетом и те же агары с лизированной кровью и генцианвиалетом. При отсутствии агара Хоттингера и Мартена может быть использован агар на гидролизате казеина или мясопептонной воде. Посев не загрязнённого посторонней микрофлорой материала (кровь, содержимое невскрывшегося бубона и т.д.) допускается производить на среды, не содержащие генцианвиолет. Мокроту платиновой петлёй (2-3 петли) или пастеровской пипеткой наносят на поверхность агара, растирают шпателем или рассеивают частыми штрихами петлёй. Шпатель или петлю без обжигания переносят на вторую и третью пластинки агара и распределяют остатки материала. Слизь из зева ватным тампоном засевают на питательный агар (обязательно с генцианвиолетом), а затем тампон с материалом тщательно прополаскивают в 1 мл бульона Хоттингера или Мартена с генцианвиолетом и хорошо отжимают о стенки пробирки. Полученную взвесь в пробирке используют для заражения животных. Кровь засевают во флаконы с бульоном, а 0,1 мл крови сеют на агаровую пластинку, растирая шпателем. Остатки крови используют для заражения животных.
Пунктат из бубона, везикулы (если материала мало, то его разводят в 0,3-0,5 мл бульона) петлёй или капилляром пастеровской пипетки засевают на поверхность агара в чашках Петри, распределяя его шпателем или частыми штрихами платиновой петлёй, а также вносят в пробирку с бульоном. Остатки материала используют для заражения лабораторных животных. Материал из вскрывшегося бубона, язвы, карбункула засевают на поверхность агаровых пластинок с генцианвиалетом и сульфитом натрия или лизированной кровью. Другие материалы (спинномозговая жидкость, мозг и т.д.) засевают в соответствии с характером материала или на поверхность агаровых пластинок и в бульон, или только на агаровые пластинки, по изложенной выше методике. Все посевы помещают в термостат при 28-30° С. Посевы начинают просматривать 16-18ч, когда можно заметить рост культуры чумного микроба в виде плоских фестончатых образований – «платочков», из которых в дальнейшем формируются типичные колонии. Путём отсевов из исходной чашки получают чистую культуру на скошенном агаре, в пробирках или на агаре в чашках для последующей идентификации. В бульоне определяют характер роста.
Идентификацию культур, предположительно относящихся к виду Y.рestis, проводят с помощью тестов:
- чувствительность выделенных культур к чумным диагностическим фагам Л-413 и Покровской: (чумной микроб лизируется этими видами фагов, а на псевдотуберкулёзный – воздействует только гомологичный фаг);
- определение подвижности бактериальных культур в 0,3% полужидком агаре при 20-22° С (определение подвижности в полужидкой среде при 20-22° С псевдотуберкулёзный микроб подвижен, а чумной – неподвижен);
- способности к ферментации мочевины (чумной микроб не ферментирует мочевину, тогда как возбудитель псевдотуберкулёза обладает этой способностью);
Для идентификации выделенной культуры может быть использована реакция гемагломерации на стекле с чумным иммуноглобулиновым эритроцитарным диагностикумом. На поверхности чашки Петри смешивают петлёй культуру – колонию или каплю суспензии бактериальной культуры с каплей (0,05-0,1 мл) чумного иммуноглобулинового эритроцитарного диагностикума 2,5% концентрации. Через 5-7 мин при помощи вогнутого зеркала проводят учёт реакции по 4-балльной шкале: «4+»-полное просветление жидкости и агломерация всех эритроцитов: «3+»-неполное просветление жидкости, агломерация основной массы эритроцитов: «2+»-неполное просветление жидкости, основная масса эритроцитов не аглометрированы: «1+»- имеются единичные частицы аглометрата: «-» - отсутствие просветления и агломерации эритроцитов.
Определяют ферментативные свойства по отношению к глюкозе, рамнозе, лактозе, арабинозе, глицерину, а также наличие синтеза капсульного антигена ФІ, пистицин- фибринолизин-плазмокоагулазную активность, чувствительность к пестицину І и ряд других тестов.
Биологический метод
Биологическое исследование является обязательным при проведении лабораторной диагностики чумы. Для биологических проб используют морских свинок и белых мышей. Исследуемый материал вводят лабораторным животным подкожно в объёме 0,5мл морским свинкам и 0,2мл белым мышам или для ускорения гибели подопытного животного – внутрибрюшинно. Если в исследуемом материале предполагается наличие банальной микрофлоры или гнилостных микробов, пользуются методом втирания материала в кожу животного. Исследуя лабораторных животных, погибших после заражения изучают патологоанатомические изменения, делают посевы паренхиматозных органов (печень, селезенка, лёгкое) лимфатических узлов и крови, а также мазки-отпечатки на предметные стекла для микроскопии.