Глава II

Классификация мобильных генетических элементов

Классификация мобильных генетических элементов основана на различиях в их структуре и связанных с ней механизмах перемещения в геноме. По основным признакам все обнаруженные до настоящего времени семейства МГЭ представлены 3 классами (рис. 3).

Рисунок 3 – Классификация мобильных элементов (Иващенко, Гришаева, 2009)

Класс I. ДНК-транспозоны или классические транспозоны

К классу I относят МГЭ, кодирующие фермент транспозазу, которая способна узнавать концы «своего» элемента и по этим концам вырезать его из хромосомы или встраивать в хромосомы генома хозяина. Такой механизм перемещения МГЭ получил название «ДНК–ДНК перемещение». ДНК-транспозоны первоначально были открыты у бактерий, но к настоящему времени обнаружены в геномах многих эукариот включая дрожжи, насекомых, червей, животных и человека. Транспозоны имеют небольшие размеры, ограничены с двух сторон короткими инвертированными повторами (ITR). Таким образом, ITR фланкируют открытую рамку считывания (ОRF), определяющую синтез транспозазы, которая необходима для перемещения элемента. ITR сближаются, узнаются транспозазой и точно отрезаются от соседних участков ДНК хозяина. Первичная структура ITR у разных семейств ДНК-транспозонов различна.

Класс II. Ретротранспозоны

К этому классу относят элементы, которые в процессе своего перемещения сначала синтезируют цепь РНК, с которой затем с помощью фермента обратной транскриптазы синтезируется комплементарная цепь ДНК. После удвоения двуцепочечная ДНК способна встраиваться в различные районы хромосом хозяина. Такой способ встраивания получил название ДНК–РНК–ДНК механизма. Класс ретротранспозонов включает три подкласса: LTR-ретротранспозоны и ретровирусы, non-LTR-ретротранспозоны и ретроэлементы.

Подкласс LTR-ретротранспозонов и ретровирусов. В подкласс LTR-ретротранспозонов входят и ретровирусы, сходные с ними по строению. Центральные районы элементов этого подкласса с обоих концов фланкированы длинными терминальными повторами (LTR). Для каждого семейства характерны свои терминальные повторы. Они отличаются длиной, варьирующей в пределах от 250 до 500 п.о. и нуклеотидной последовательностью, которая обычно много консервативнее, чем остальные части элемента. Основной чертой этих элементов является активная транскрипция РНК. Ретротранспозоны и ретровирусы содержат гены gag и pol, которые кодируют антигены групповой специфичности, обратную транскриптазу, рибонуклеазу и интегразу для обеспечения обратной транскрипции кДНК с РНК. Различия между семействами ретротранспозонов и ретровирусов связаны с геном env, который кодирует белок оболочки вирусов, давая вирусам возможность перемещаться между клетками. У ретротранспозонов с LTR имеются только остатки этого гена, что обусловливает их внедрение только в тот геном, из которого они были вырезаны. LTR-ретротранспозоны распространены в геномах практически всех эукариот: в ДНК растений, грибов, позвоночных и беспозвоночных животных.

Подкласс non-LTR-ретротранспозонов или ретропозонов. К подклассу non-LTR-ретротранспозонов или ретропозонов относятся LINE (long interspersed nuclear element) и SINE- (short interspersed nuclear element) элементы. Известно около 20 семейств элементов группы LINE, в частности F, G, Doc, jockey, Helena, Het-A, TART у дрозофилы, L1 у млекопитающих, ingi у трипаносомы и cin4 у кукурузы и т. д. Длина полноразмерных ретропозонов составляет 3,5–8 т.п.н. Они обладают двумя рамками считывания (ORF), которые кодируют ферменты, необходимые для их перемещения. Основными продуктами ORF являются белок, а также эндонуклеаза и обратная транскриптаза. У ретропозонов в отличие от LTR-ретротранспозонов процесс обратной транскрипции происходит на ядерной ДНК с использованием сайта-мишени в качестве праймера. Большинство ретропозонов не являются сайт-специфичными и могут мигрировать в очень большое число сайтов. Надсемейство ретроэлементов SINE включает короткие (около 300 п.н.) и рассеянные по геному последовательности. Они найдены в геномах человека, грызунов, рыб, лягушек, растений и насекомых. Для этого семейства характерно присутствие центрального района, повторяющего 3′-нетранслируемый участок элементов LINE. Предполагается, что LINE могут влиять на подвижность SINE элементов.

Подкласс ретроэлементов (Penelope-like elements). Penelope-подобные элементы представляют собой необычный класс ретротранспозонов, которому присущи характеристики всех ретроэлементов. Penelope был впервые обнаружен в геноме Drosophila virilis как элемент, играющий основную роль в процессе гибридного дисгенеза. Позже Penelope-подобные элементы были найдены в геномах многих эукариот: у ракообразных, червей, рыб, амфибий и пресмыкающихся. Как и у ретропозонов, у них часто прослеживается наличие усеченного 5′-конца и варьирующих по длине дупликаций сайтов-мишеней. С другой стороны, некоторые из них имеют LTR либо в прямой, либо в инвертированной ориентации. Важным обстоятельством является то, что у всех элементов этого нового семейства найден классический интрон в гене, кодирующем обратную транскриптазу.

Класс III. Пассивные элементы типа fold-back

К этому классу относят семейство элементов FB (fold-back). Размеры этих МГЭ варьируют от нескольких сотен до нескольких тысяч пар оснований. Длинные инвертированные повторы, расположенные на концах FB-транспозонов, имеют достаточно сложную внутреннюю организацию из более мелких повторов, которые представляют собой тандемные копии простых последовательностей, разделенных длинными участками различающихся последовательностей. Такие элементы обнаружены у дрозофилы, растений. Было показано, что некоторые нестабильные мутации у дрозофилы были вызваны инсерциями FB. Механизм перемещения FB элементов пока не известен.

Способы перемещения

Различают два основных класса подвижных элементов: транспозоны и ретротранспозоны. Такая классификация основана на молекулярных механизмах, с помощью которых перемещаются подвижные элементы. Транспозоны перемещаются с участием комплекса белков, обеспечивающего активность фермента транспозазы, которая узнает элемент и обеспечивает его перенос на новое место. Транспозоны ограничены с двух сторон так называемыми инвертированными повторами, то есть последовательностями, направленными навстречу друг другу. Инвертированные повторы необходимы для перемещения элемента, которое осуществляется благодаря их сближению друг с другом и узнаванию транспозазами. Инвертированные повторы сближаются и точно отрезаются от соседних участков ДНК хозяина. Успешному вырезанию элемента способствует дополнительная сверхспирализация двухнитевой спирали ДНК, обеспечивающая изгибы двойной спирали и сближение отдельных ее участков. Вырезанный транспозон внедряется в район вносимого транспозазой разрыва в молекуле-мишени и сшивается с ДНК хозяина в новом месте. Разрыв и зашивание осуществляются транспозазой и вспомогательными белками. Транспозаза может кодироваться как самим подвижным элементом, который будет перемещаться, так и другой копией элемента, локализованной в том же геноме в отдалении.

Рисунок 3 — Механизм перемещения ДНК-транспозона

Итак, подвижность элементов становится возможной благодаря активности ферментов, которые способны точно вырезать элемент из хромосомы для того, чтобы затем вставить его в какое-то другое место генома. Брешь в ДНК, оставляемая после вырезания транспозона, может залечиваться - застраиваться с участием гомологичного участка, например, сестринской, только что редуплицированной молекулы ДНК. В итоге залечивается дырка на месте вырезанного транспозона, а число копий транспозона увеличивается на одну копию.

Бактериальный транспозон кроме гена транспозазы может содержать ген, обеспечивающий устойчивость бактерии к тому или иному антибиотику - пенициллину, тетрациклину.

Другой большой класс подвижных элементов - это ретротранспозоны, они не вырезаются из хромосомы, как это делают транспозоны. Механизм их перемещения основан на существовании открытой в 1970 году Г. Теминым и Д. Балтимором реакции обратной транскрипции - синтеза нити ДНК на РНК. Химическая реакция протекает так же, как при образовании нити комплементарной ДНК на ДНК-матрице при репликации двухнитевой молекулы ДНК. Ретротранспозоны используют РНК в качестве посредника.

Рисунок 4 — Tранспозиция в новый сайт генома хозяина двух типов мобильных элементов посредством вырезания и последующей интеграции участа ДНК (слева) и с помощью РНК-посредника, сопровождаемая обратной транскрипцией кДНК и ее вставкой в новый сайт генома (справа)

Рисунок 5 — Перемещения ретротранспозонов

Ретротранспозоны транскрибируются подобно другим последовательностям генома, и полученная РНК используется в качестве матрицы для синтеза кДНК с помощью фермента обратной траскриптазы, кодируемого ДНК транспозона. Новосинтезированный ретротранспозон встраивается в другой участок генома.

Обратная транскрипция была обнаружена при изучении ретровирусов, содержащих РНК, которая служит матрицей при образовании ДНК-копии РНК вируса. Фермент, осуществляющий эту реакцию синтеза ДНК на РНК (вспомним, что транскрипция - это синтез РНК на ДНК), называют обратной транскриптазой или ревертазой. Ревертаза не только ведет синтез нити ДНК на РНК, но и осуществляет синтез второй комплементарной нити ДНК, а РНК-матрица распадается и удаляется. Двухнитевая ДНК синтезируется в цитоплазме, а затем перемещается в ядро и может встроиться в геном, образуя провирус. Находясь в хромосоме, провирус стабильно наследуется в ряду поколений как обычный ген. В хромосомах млекопитающих содержатся так называемые эндогенные провирусы, которые безвредны, а может быть, даже несут какие-нибудь биологические функции. Провирус ограничен так называемыми длинными концевыми повторами (ДКП), содержащими обычно по 250-700 нуклеотидных пар. Они необходимы для транскрипции провируса и его репликации (воспроизведения). Левый повтор содержит промотор, с которым взаимодействует РНК-полимераза, начинающая синтез РНК. Синтезированная молекула РНК, равно как и РНК из вирусной частицы, заразившей клетку, транслируется с образованием белков-ферментов, необходимых для синтеза ДНК провируса и его внедрения в геном, а также белков самой вирусной частицы. В некоторых случаях может образоваться зрелый вирус, содержащий РНК, упакованную в белковую оболочку. Вирусная частица может выйти из одной клетки и заразить другие. Для встраивания (интеграции) ДНК провируса необходим фермент интеграза, разрезающий ДНК-мишень и сходный по механизму своего действия с транспозазой. Наличие ДКП не только обеспечивает транскрипцию, но и полноценную репликацию провируса с двумя ДКП. Может случиться, что в процессе обратной транскрипции и репликации ДНК в состав будущего провируса случайно попадет материал других клеточных генов, если, например, ревертаза будет копировать какие-либо клеточные РНК. Ревертаза работает неточно, она может вносить ошибки в нуклеотидную последовательность ДНК, образующуюся на РНК, в отличие от ДНК-полимеразы, работающей почти безошибочно при воспроизведении всех хромосом. Если такая ошибочно скопированная последовательность, соответствующая некоторым важным генам, управляющим размножением клеток, попадет в состав провируса и, следовательно, в геном клетки, то это событие может привести к злокачественному перерождению клетки, поскольку клетка теперь будет нести ген, кодирующий измененный белок, отвечающий за рост и размножение клеток. Поэтому ретровирусы, несущие протоонкогены, опасны для клетки и организма.

Активные ретротранспозоны млекопитающих делятся на три основные семьи: Alu-повторы, ДДП-1, SVA.

ДДП-1 ретротранспозоны - длинные диспергированные повторы - тип ретротранспозонов, который широко распространён у млекопитающих и составляет до 20 % генома. ДДП-1 элементы имеют длину около 6 тысяч пар оснований. Большинство этих ретротранспозонов в геноме представлено неполно, хотя существует примерно 150 полных и потенциально мобильных ДДП-1 элементов в последовательности ДНК человека и примерно 3000 - у мыши.

ДКП - длинные концевые повторы - ретротранспозоны, имеющие конечные повторяющиеся последовательности, которые играют важную роль в транскрипции и обратной транскрипции РНК транспозона. ДКП-элементы кодируют белки pol и gag, которые близки к белкам ретровирусов, но, в отличие от последних, ДКП не хватает белков, которые смогли бы сформировать внешнюю оболочку (суперкапсид) и выйти из клетки.

КДП - короткие диспергированные повторы, являются неавтономными ретротранспозонами: они требуют активности ДДП-1 элементов для передвижения, в ДНК последовательности КДП содержат только участок связывания РНК-полимеразы. В число КДП входят Alu-ретротранспозоны.

Alu-повтор (Alu от Arthrobacter luteus) - широко распространённые мобильные элементы в геноме человека. Alu-элементы имеют длину около 300 пар оснований и часто расположены в интронах, участках генома, которые не транслируются, и межгенных участках. Приставку Alu - ретротранспозоны получили за то, что они содержат последовательность распознавания рестрикционного энзима AluI. Анализ последовательностей показал, что Alu - элементы возникли у приматов примерно 65 миллионов лет назад от гена 7SL РНК, который входит в рибосомный комплекс. Alu-ретротранспозоны не имеют собственной обратной транскриптазы, поэтому для передвижения им необходимые ферменты ДДП-1 элементов.

SVA - мобильные элементы длиной в 2-3 тысячи пар оснований ДНК, состоящие из нескольких частей. SVA элементы значительно варьируют в длину из-за разного количества составляющих повторов. Они не являются автономными и нуждаются в белках, закодированных в ДДП1 ретротранспозонах для передвижения, но они активны в геноме человека. SVA-элементы претерпевают высокий уровень метилирования ДНК в большинстве тканей человека.

Ретротранспозоны широко распространены у эукариот, населяя геномы дрожжей, растений, насекомых и позвоночных, включая человека. Ретротранспозоны пока не обнаружены у прокариот. Тысячи различных семейств ретротранспозонов могут занимать до 70-85% ядерной ДНК растений и животных. Около 75% генома кукурузы представлено ретротранспозонами, главным образом ДКП типа. В то же время маленький геном дрожжей Saccharomices cerevisiae содержит только лишь пять семейств ДКП ретротранспозонов, занимающих лишь 3% их геномной ДНК. В геноме Arabidopsis обнаружено несколько сот семейств ДКП и без ДКП ретротранспозонов, которые составляют около 14% его ядерной ДНК. У млекопитающих число LINE и SINE может достигать сотни тысяч копий, составляя 35% величины их генома. В целом разнообразие и численность мобильных элементов в геномах растений выше, чем у представителей других царств. На рис. 6 отображена представленность различных типов транспозонов в геноме человека.

Рисунок 6 — Представленность транспозонов в геноме человека