Получение инсулина на опытном производстве

ИБХ РАН Патент РФ RU 2325440

Физическая карта плазмиды	Штамм-продуцент Escherichia coli bgg18
pGG-1
	Содержит искусственный
	ген, кодирующий гибридный
	полипептид, состоит из
	-одного IgG-связывающего
	домена белка А из
	Staphylococcus aureus,
	-пептидного линкера
	His6GlySerArg
	- проинсулин человека,
	- гибридный tac-промотор
	- терминатор рибосомного
	оперона E.coli,
	- ген bla, кодирующий -
	лактамазу, которая придает
	клеткам устойчивость к
3,3 МДа (5051 п.о.)	ампициллину

Упрощенная технология выделения инсулина Glargin

Гибридный белок состоит из линейного проинсулина Glargin и присоединенного к его N- концу через остаток метионина домена В белка А Staphylococcus aureus и пептидный линкер His6GlySerArg.

Белок выделяют методами аффинной хроматографии с использованием IgG-сефарозы и хелатной хроматографии на колонках с Ni- агарозой.

Характеристика штамма-продуцента Escherichia coli bgg18

•Культурально-морфологические признаки: клетки мелкие, палочковидной формы, грамотрицательные, 1×3,5 мкм, подвижные. Штамм хорошо растет на обычных питательных средах (МПА, МПБ, LB-бульон, LB-агар, минимальная среда с глюкозой).

Физиолого-биохимические признаки: клетки растут при 4-42°С, оптимум рН 6,8-7,6. В качестве источника азота используют как минеральные соли аммония, так и органические соединения: аминокислоты, пептон, триптон, дрожжевой экстракт. В качестве источника углерода при росте на минимальной среде используют глицерин, углеводы, аминокислоты.

Устойчивость к антибиотикам: клетки штамма-продуцента проявляют устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл)

•содержание рекомбинантных полипептидов в бактериальных клетках после завершения индукции составляет не менее 25% от суммарного клеточного белка.

СХЕМА ПРОИЗВОДСТВА ИНСУЛИНА

Условия синтеза рекомбинантного белка

Состав питательной среды

Бактопептон Дрожжевой экстракт

Калий фосфорнокислый двузамещенный Калий фосфорнокислый однозамещенный Натрий хлористый Магний сернокислый Глюкоза

Условия культивирования (8 ч)

37оС, рН7,0, Ри = 0,25 атм

Индукция синтеза рекомбинантного белка

Введение индуктора, 4-5 ч. Индуцибельный tac-промотор активируется ИПТГ.

•Индуктор – изопропил- -D- тиогалактозид (ИПТГ, аналог лактозы) репрессирует глюкозный оперон и дерепрессирует лактозный оперон (0,05 мМ)

Выход с 1000 л КЖ:

-70 кг влажной биомассы

-17 кг телец включения

-2,1 кг суммарного белка

-1,8 кг РБ

-1,4 кг после ренатурации

-0,131 кг инсулина

Технологическая схема получения инсулина

Получение посевного материала штамма-продуцента (150 л инокулята)

Выращивание продуцента в ферментере объемом 3000 л (ферментация)

Отделение биомассы (центрифугирование) Дезинтеграция клеточной суспензии (4 цикла 600атм)

Выделение и отмывка телец включения (центрифугирование)

Выделение и очистка рекомбинантного белка

Солюбилизация телец включения и восстановление рекомбинантного белка (HS-R-SH, 20 мМ, 20оС, 20 час дитиотреитол)

Ренатурация рекомбинантного белка (HS-R-SH, R-S-S-R, 72 час)

Хроматографическая очистка рекомбинантного белка

Ферментативное расщепление рекомб. белка (Трипсин, СР В, 37оС, 30 мин)

Хроматографическая очистка инсулина

Получение кристаллического инсулина

Получение инсулина

Структура рекомбинантного белка

Условия восстановления РБ:	Условия ферментативного
8 М мочевина, 5 мМ дитиотреитол	расщепления рекомб. белка:
рН 8,0, 3 ч	Трипсин, карбоксипептидаза В,
	37оС, 30 мин

Условия ренатурации РБ:	Получение кристаллического
рН 9,5, 25 мМ трис-НСl буфер	инсулина (цинк-инсулина):
5оС, 72 ч	хлорид цинка, рН 6,0

Условия хроматографической очистки рекомбинантного белка

ДЭАЭ-сефароза, элюция раствором 25 мМ трис-НСl рН 7,5, градиент NaCl

Схема ферментативного гидролиза РБ

Пирогены

•вещества, которые, попадая в организм извне или образуясь внутри него, вызывают повышение температуры тела (лихорадку). Экзогенные пирогены чаще всего представляют собой компоненты инфекционных возбудителей. Наиболее

сильными из них являются капсульные термостабильные липополисахариды

грамотрицательных бактерий (бактериальные эндотоксины) .

Определение пирогенности

•По Фармакопее XIII издания (ОФС.1.2.4.0005.15) производится на здоровых кроликах обоего пола весом 1,5—2,5 кг. Исходная температура их должна быть в пределах 38,2—39,5° С. После введения испытуемой жидкости у кроликов три раза (через каждый час) определяют температуру. Если при этом у двух или более кроликов температура поднимется более чем на 0,6°, то раствор или воду считают пирогенными и непригодными для парентерального применения.