ОПРЕДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭНДОТОКСИНОВ

•По Фармакопее XIII издания

•(ОФС.1.2.4.0006.15) производится

•ЛАЛ- тест (или ТАЛ)

•Краб мечехвост - древнейшее морское животное

•введение бактерий во внутрисосудистое русло мечехвостов

вызывает свертывание крови и гибель животного

•Гемолимфа имеет голубую окраску и содержит только один тип клеток - амебоциты. Так как в морской воде, особенно в придонном ее слое - месте обитания мечехвостов, очень высока концентрация бактерий, природа подарила этим крабам примитивный, но очень надежный механизм защиты от вторжения патогенных бактерий. Любое повреждение покровов крабов- мечехвостов приводит к контакту клеток крови амебоцитов с бактериями, которые выступают в роли активаторов, "пускового механизма" реакции свертывания крови. Образовавшийся сгусток крови препятствует дальнейшей ее потере, закупоривая место повреждения, и предохраняет животное от заражения. Но несмотря на свою примитивность по сравнению с системами коагуляции млекопитающих и человека, этот защитный механизм исправно служит мечехвосту уже много миллионов лет.

•реактив содержит клетки крови краба-мечехвоста

Клеточная инженерия Соматическая гибридизация

Протопласт клеток листа петунии

Генетическое конструирование in vivo (клеточная инженерия)

включает получение и выделение мутантов и использование различных способов обмена наследственной информацией живых клеток

Основой клеточной инженерии является слияние неполовых клеток (гибридизация соматических клеток) с образованием единого целого.

Протопласт – это растительная или бактериальная клетка без клеточной стенки, окруженная цитоплазматической мембраной. Протопласт получают, обрабатывая клетку ферментами, которые гидролизуют полимеры в клеточной стенке.

Получение бактериального продуцента цефалоспорина

Методики протопластирования

Acremonium chrysogenum

Основной способ трансформации мицелиальных грибов в мировой практике - метод, основанный на получении протопластов

Стабилизация протопластов

Гипертонический раствор, состоящий из 10%-ных маннита, сахарозы, хлорида натрия. Ионная сила раствора такова, что клетка находится в состоянии тургора, но не лопается, при этом раствором также

производится отмывание фермента.

Слияние протопластов.

Слияние протопластов производится в среде ПАВ в полиэтиленгликоле, который нарушает клеточную цитоплазму и ДНК двух протопластов объединяются. Этот процесс происходит постепенно. "ПЭГ - высокие значения рН - высокая концентрация Са2+", которая дает до 50% слившихся протопластов (рН 9 - 11, концентрация Са2+ 100 - 300 ммоль/л).

(Используют действие постоянного и переменного электрического тока, инактивированный вирус Сендай )

Для облегчения клетке процесса фузии (слияния) клетку необходимо сделать компетентной. Для этого:

1.обрабатывают клетку тяжелыми металлами

2.производят быструю заморозку и оттаивание клеток

3.обрабатывают клетки ферментами.

При слиянии получается протопласт с двумя наборами хромосом – диплоидный

набор (при образовании гибрида происходит рекомбинация ДНК).

Регенерация (восстановление клеточной стенки протопласта).

Полученный гибрид засевают на плотную питательную среду с необходимыми компонентами для прокариот и эукариот. При этом происходит восстановление клеточной оболочки.

Для того, чтобы отличить гибридную клетку от негибридной, необходимо на стадии слияния включить еще один протопласт, несущий

маркер. Маркер – это участок гена, кодирующий какой-либо фермент, позволяющий отличить гибрид при высеве на питательную среду. В данном случае маркером является β-лактамаза. В среду добавляют бензилпенициллин и вырастают только те клетки, которые содержат β- лактамазу, расщепляющую его. А так как β-лактамазу содержат только клетки гибриды, то на среде и вырастают только гибриды.

Техника парасексуальной гибридизации может позволить:

1.скрещивание филогенетически отдаленных видов растений (организмов),

2.получение асимметричных гибридов, несущих генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами, органеллами или цитоплазмой другого,

3.слияние трех и более клеток,

4.получение гибридов, представляющих сумму генотипов родителей,

5.перевод мутаций в гетерозиготное состояние, что позволяет получать жизнеспособные формы при слиянии протопластов, поскольку мутагенез довольно часто дает дефектное по морфогенезу растение,

6.получение растений, гетерозиготных по внеядерным генам и др.