33.Метод иммунного блоттинга

В практике лабораторной диагностики инфекционных заболеваний существует иногда необходимость определять антитела не вообще к патогену, а к определенным его белкам (антигенам), то есть спектр специфических антител.

Иммунный блотинг позволяет определять в сыворотке крови антитела одномоментно и в то же время дифференцированно ко всем диагностически значимым белкам патогена. Перевод с английского Western blot означает западный перенос (дословно — промакивание).

Этапы:

На первом этапе этого метода осуществляют электрофоретическое разделение смеси белков патогена в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН). ДСН, являясь поверхностно активным веществом, равномерно обволакивает молекулы белка и придает всем им отрицательный заряд приблизительно равной величины. Поэтому молекулы движутся в электрическом поле в одном направлении, а скорость продвижения зависит только от размеров молекулы (молекулярной массы) белка.

В результате электрофоретической процедуры получают гелевую пластину, в толщине которой в виде отдельных тонких линейных зон располагаются белки. По направлению движения они разделяются в следующем порядке: ближе к старту находятся белки большой молекулярной массы, порядка 120—150 кДа, а к финишу далее всех продвинулись протеины массой 5—10 кДа.

На втором этапе гелевую пластину накладывают на лист нитроцеллюлозы и помещают эту конструкцию между электродами источника постоянного тока (рис. 21.26). Под действием электрического поля белки перетекают из пористого геля на более плотную мембрану, где достаточно прочно закрепляются.

Полученный блот обрабатывается блокирующим раствором, содержащим индифферентные в антигенном отношении белки и/или неионные детергенты (Твин 20), которые блокируют на мембране свободные от антигена места. Затем лист-мембрану разрезают на узкие полоски таким образом, чтобы каждая полоска содержала все антигенные фракции. Описанные этапы выполняются фирмой-производителем.

В результате последовательного проведения иммунных и ферментативной реакции при наличии в исследуемой пробе антител к белкам патогена на блоте появляются темные поперечные полоски, расположение которых находится в зоне определенных белков патогена. Каждая такая полоса свидетельствует о наличии специфических антител к соответствующему антигену. Результат исследования, проведенного методом иммунного блотинга, выдается в виде перечисления антител к конкретным белкам патогена. Например: «выявлены антитела к белкам р17 и р24».

Нитроцеллюлозные блоты после проявления могут долго храниться в высушенном виде. Однако интенсивность окраски при этом значительно ослабевает. Влажные блоты можно фотографировать или с помощью сканеров вводить их графическое изображение в память персональных компьютеров. Специальные компьютерные программы позволяют обрабатывать полученные результаты и оперативно отслеживать динамику спектра антител при динамическом наблюдении.

Этот метод широко применяется для подтверждения результатов твердофазного ИФА при диагностике ВИЧ-инфекции.