Селекционеры микроорганизмов, как правило, используют индуцированный мутагенез, который способствует резкому увеличению частоты мутаций биообъекта при искусственном повреждении генома. Мутагенным действием обладают ультрафиолетовое, рентгеновское или γ-излучение, корпускульные излучения типа быстрых электронов, позитронов, протонов, нейтронов, а также некоторые химические соединения, вызывающие изменения первичной структуры ДНК. К числу наиболее зарекомендовавших себя мутагенов относятся азотистая кислота, алкилирующие агенты, акридиновые красители, бромурацил и др. К биологическим мутагенам относятся фаги.

Впервые в истории микробиологии и генетики возможность экспериментального получения мутаций у микроорганизмов была установлена советскими учеными Г.А. Надсоном и Г.С. Филипповым в 1925 г. С помощью рентгеновских лучей они нашли наследственно стойкие варианты Mucor genevensis. Широкое использование УФ- и рентгеновских лучей началось после Второй мировой войны в селекции активных продуцентов антибиотиков.

Мутационные изменения затрагивают целый ряд генов и приводят как к физиологическим, так и к морфологическим изменениям мутанта, в результате которых могут меняться требования мутанта к питательной среде и к условиям культивирования.

Последовательное воздействие одного или нескольких мутагенных факторов при ступенчатом отборе позволяет постепенно увеличить продуктивность штамма. Например, путем многократного воздействия мутагенами и отбора удалось синтетическую способность продуцента пенициллина гриба Penicillium chrysogenum в течение 40 лет увеличить в 12 тыс. раз.

Недостатками метода индуцированного мутагенеза и последующего ступенчатого отбора являются:

- трудоемкость;

- отсутствие сведений о характере мутаций, т.к. селекционер проводит отбор по конечному результату.

Для выделения из природных популяций сверхпродуктивных штаммов используются разно-образные методы.

Селекция – это искусственный отбор организмов с лучшими в своем поколении показателями. Главный недостаток этого метода – его чрезвычайная длительность. Более эффективен индуцированный мутагенез, основанный на мутагенном воздействии рентгеновского и УФ- излу-чения или некоторых химических соединений. Мутагены вызывают изменения ДНК, приводящие к сдвигу метаболических реакций, в результате чего часть обычных клеток превращаются в

сверхпродуцентов.

      Как правило, методы мутагенеза и селекции используются в совокупности. Например, так были получены высокопродуктивные штаммы бактерий Bacillus subtilis, способные выделять

до 75 кг витамина В2 из тонны питательной смеси.Достижения в области генетики и молеку-лярной биологии позволили биотехнологам начиная с 70_х гг. прошлого века, перейти от слепого отбора штаммов мутантов к сознательному конструированию геномов, используя для этой цели технологию рекомбинантной ДНК – основу современной генной инженерии.

Повышение активности гриба Penicillium citrinum – продуцента компактина, методом индуцированного мутагенеза и оптимизация условий культивирования высокопродуктивных штаммов

 

Украинцева с.Н., Воинова т.М., Джавахия в.Г.

 

В процессе оптимизации состава питательных сред для вновь полученных высокопродуктивных по компактину мутантных  штаммов гриба Penicillium citrinum удалось заменить дорогостоящий мясной пептон на соевый. Выявлено, что при щелочных значениях pH культуральной жидкости часть компактина переходит в водорастворимую солевую форму и выводится из клеток гриба в культуральную жидкость. Оптимальная концентрация сахарозы в среде оказалась на 50 г/л выше, чем в исходной среде. Получен новый спорулирующий высокопродуктивный мутант гриба Penicillium citrinum 20-01. Это позволило определить оптимальную концентрацию спор для засева вегетативной среды – 10⁶ спор на 1 мл среды.  Совместное использование дрожжевого экстракта, увеличенных концентраций нитратного азота и сахарозы позволило увеличить продуктивность штаммов 18–12 и 20–01  с 7–8  г/л до 12–12,5 г/л. Получен новый спорулирующий штамм 21-34, способный продуцировать компактин на оптимизированной среде до 15 г/л.

 

The expensive meet peptone was substituted by a soy peptone in the process of optimization of composition nutrient medium for new obtained higly productive mutants of Penicillium citrinum. The obtained results confirmed that a part of compactin was converted into water-soluble saline form and some part of this saline form liberated from cells to culture liquid at alkaline pH. The optimal concentration of sucrose is more on 50  g/ in optimal medium, than in initial medium. A new sporulating mutant strain 20-01 of Penicillium citrinum with a high productivity of compactin was obtained by induced mutagenesis. This allowed to determine the optimal concentrations of spores for inoculation of vegetative medium – 10⁶ spores for 1 ml of medium. The compatibility using of yeast extract, higher concentration of NaNO₃ and sucrose  allowed to increase of strains productivity (18-12 and 20-01) from 7-8 to 12-12,5 g/l. A new obtained sporulating strain 21-34  allowed to produce up to 15 g/l of compactin on optimized medium.

 

Атеросклероз является сложным заболеванием, связанным с рядом различных нарушений в организме. Особое значение в его развитии играет метаболизм липидов, и в первую очередь холестерина. Холестерин – это основной стерин в клетках животных и человека, который входит в состав клеточных мембран, а также является предшественником желчных кислот и стероидных гормонов. Нарушение обмена холестерина в организме человека приводит к такому тяжелому заболеванию, как атеросклероз.

Некоторые препараты для лечения и профилактики атеросклероза известны и используются давно. Самыми эффективными средствами для лечения являются соединения нового класса – статины. Препараты данного класса конкурентно ингибируют фермент 3-гидрокси-3-метил глютарил А редуктазу (ГМГКоА-редуктазу), блокируя тем самым превращение ГМГКоА в мевалоновую кислоту, которая является субстратом для синтеза холестерина.

Компактин это вещество поликетидной природы, относящееся к группе статинов. Компактин используется только для получения его производного – правастатина, который в несколько раз превосходит по активности исходный препарат.

Продуцентом компактина является культура гриба Penicillium citrinum. Ранее, из исходного штамма SANK 18767 P. citrinum, синтезирующего 10-50 мг/л компактина в жидкой среде, в нашей лаборатории методом последовательного индуцированного мутагенеза были получены мутанты, способные продуцировать 7-8 г/л этого вещества (в частности штамм 18-12) [1].

Целью данной работы было изучение возможности повышения продуктивности мутанта 18-12 путем генетической модификации, а также путем дальнейшей оптимизации ферментативной среды.

 

Среды и условия культивирования. Штамм 18-12 и новые мутанты культивировали на агаризованной среде следующего состава: агар-агар “Difco” - 20 г, глюкоза -30 г, глицерин - 70 г, соевая мука - 10 г, мясной  пептон “Difco” - 10 г, NaNO₃ – 2 г, MgSO₄ x 7H₂O - 1г, дистиллированная вода - 1 л (pH до стерилизации 5,7 - 6,0). Культуру гриба  выращивали при температуре 24 ⁰С в течение 12 суток.

Вегетативную культуру выращивали в колбах на качалке при 210 об/мин в течение 72 часов при температуре 24⁰ С. Состав вегетативной среды: сахароза -100 г, соевая мука - 20 г, мясной пептон “Difco”  - 10 г, NaNO₃ - 2 г, MgSO₄ x 7H₂O - 1 г, дистиллированная вода - 1 л (pH среды до стерилизации 5,7 - 6,0).

Вегетативную культуру (1 мл) инокулировали в качалочную колбу, объемом 100 мл, содержащую 10 мл стерильной питательной среды. В качестве исходной ферментативной среды использовали разработанную ранее питательную среду следующего состава: сахароза - 100 г, соевая мука - 30г,  мясной пептон “Difco” - 10 г, NaNO₃ - 2 г, MgSO₄  x 7H₂O - 1 г, дистиллированная вода - 1 л (pH среды до стерилизации 5,7 - 6,0). Ферментативную культуру выращивали в колбах на качалке при 210 об/мин и температуре 24 ⁰С.

Через 68-72 часа культивирования в среду добавляли 50-% раствор сахарозы до конечной концентрации 200 г/л. Культивирование продолжалось в течение 240-264  часов на качалке при тех же условиях.

Вышеописанные условия культивирования были в свое время разработаны для мутантов предыдущей серии, продуцировавших около 5 г/л компактина. Мы предположили, что оптимизация состава питательной среды и условий культивирования позволит определить максимальную продуктивность новых мутантов.

 

Мутагенез. В качестве мутагенного фактора были использованы ультрафиолетовые лучи с длиной волны 254 нм (лампа VL-6.C, мощность 6 W). Время облучения составляло 5 – 35 минут, расстояние от источника облучения до суспензии 25 см. Мутанты отбирали по морфолого-культуральным признакам среди выросших после облучения колоний при выживаемости не более 2%.

Анализ содержания компактина в конечном объеме культуральной жидкости. Мутанты культивировали в ферментативной жидкой среде в течение 240–264 часов. Компактин экстрагировали из культуральной жидкости с помощью этилацетата. Количественное содержание компактина в культуральной жидкости определяли методом  ВЭЖХ (Model Gilson, detector UV/VIS 151, мобильная фаза: метанол / уксусная кислота 0,1%  80:20, аналитическая колонка С₁₈ Силасорб (Элсико), поток 1 мл/мин).

Для определения содержания компактина в клетках мицелия и супернатанте  культуральной жидкости 10 мл культуральной жидкости центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 минут. Экстракцию осадка мицелия и супернатанта культуральной жидкости проводили отдельно с помощью этилацетата.

 

Оптимизация питательных сред. Для наиболее продуктивных мутантов оптимизировался состав ферментативной среды. Дополнительно исследуемые компоненты добавляли к питательной среде перед стерилизацией.

 

Результаты и обсуждения. Полученный в нашей лаборатории в процессе многолетних работ мутантный штамм P. citrinum 18-12 способен синтезировать 7-8 г/л компактина при глубинном культивировании на питательной среде. Этот штамм был использован для получения новых мутантов с повышенной продуктивностью  методом индуцированного мутагенеза.

Вновь полученные мутанты были тестированы на способность синтезировать компактин в колбах при глубинном культивировании. Продуктивность большинства мутантов была равна или меньше продуктивности исходного штамма 18-12. Продуктивность нескольких мутантов превышала продуктивность контрольной колонии на 10-15%. Один из полученных спорулирующих штаммов (20-01) был использован в некоторых экспериментах по оптимизации ферментативной среды наряду со штаммом 18-12.

Используемая ранее ферментативная среда при культивировании штамма 18-12 позволяла получать в большинстве опытов 7-8 г/л компактина после 240-264 часов ферментации. Однако выход компактина варьировал в пределах от 4 до 9 г/л. Было отмечено, что увеличение синтеза компактина коррелировало с повышением значения pH ферментативной среды до 7,0 – 7,5 в конце ферментации, тогда как в большинстве ферментаций конечное значение pH ферментативной среды было на уровне 5,0 – 5,5. В связи с этим был проведен ряд опытов по анализу корреляции между конечной  концентрацией компактина в культуральной жидкости и финальным значением рН. В процессе оптимизации среды было изучено влияние практически всех компонентов, используемых в ферментативной среде.

При замене мясного пептона “Difco” в ферментативной среде на триптон “Difco” и различные соевые пептоны (очищенный “Sigma” и технический “Sigma”) значение pH среды, морфология гриба и биомасса практически не изменялись. При культивировании штамма 18-12 гриба P. citrinum  выход компактина увеличивался на ферментативной среде, в состав которой входил триптон. Использование соевого пептона (технического и очищенного) также приводило к увеличению концентрации компактина. В связи с тем, что компактин используется в фармакологической промышленности, оптимальным было бы использование в среде соевого пептона, что также обусловлено дешевизной соевого пептона, как одного из основных компонентов питательной среды. Дальнейшие эксперименты проводились с использованием соевого технического пептона.

Известно, что в процессе ферментации гриб синтезирует кислотную форму компактина, которая локализована внутри клеток мицелия. Вероятно, при защелачивании среды происходит переход кислотной формы компактина в менее токсичную солевую водорастворимую форму, которая, к тому же, частично выделяется в питательную среду, снижая тем самым пресс токсичности внутри клеток гриба-продуцента. Полученные результаты подтвердили предположение о том, что при щелочных значениях pH часть компактина переходит в водорастворимую солевую форму и выводится из клеток гриба в культуральную жидкость. В связи с этим можно предположить, что одним из необходимых, но недостаточных критериев высокой продуктивности мутантов должно быть естественное защелачивание среды в конце ферментации до 7,0–8,0. Защелачивание питательной среды выше значений 8,0 приводило к распаду компактина в культуральной жидкости.

Одним из условий активного биосинтеза компактина являлось наличие в ферментативной среде высоких концентраций сахарозы (общая концентрация 200 г/л). Повышение концентрации сахарозы, добавленной через 72 часа культивирования со 100 г/л до 150 г/л приводило к увеличению продуктивности штаммов (18-12 и 20-01) на 15–30%, дальнейшее увеличение концентрации сахарозы приводило к снижению биосинтеза компактина. Все дальнейшие эксперименты проводились с добавлением сахарозы в процессе ферментации в концентрации 150 г/л (общая концентрация сахарозы составляла 250 г/л).

Однако, увеличение концентрации сахарозы приводило не только к повышению продуктивности штаммов, но и к понижению конечных значений pH до кислой области в пределах 5,0–6,5, что, вероятно, не способствовало переходу кислотной формы в менее токсичную солевую и выходу части компактина из клеток мицелия. В связи с этим был тестирован ряд компонентов, способных поддерживать pH в щелочной области в конце ферментации. Были тестированы компоненты, способные искусственно поддерживать рН в щелочной области такие, как лимонная кислота в сочетании с карбонатом кальция, дрожжевой экстракт и нитрат натрия в различных концентрациях.

Наиболее эффективным оказалось добавление дрожжевого экстракта (1 г/л) и повышение концентрации нитрата натрия с 2 до 5 г/л. Использование дрожжевого экстракта в питательной среде способствовало процессу ферментации в области оптимальных значений pH 6,5–7,5.

Совместное использование дрожжевого экстракта, увеличенных концентраций нитратного азота и сахарозы позволило повысить  продуктивность штаммов 18-12 и нового спорообразующего штамма 20–01 до 12–12,5 г/л. Наличие в среде дрожжевого экстракта наряду с увеличением концентрации NaNO₃ до 5 г/л позволило стабилизировать параметры роста гриба и синтеза компактина.

В связи с отсутствием конидий у изолята 18-12 процесс инокуляции вегетативной среды не был оптимальным, так как использовались обрывки мицелия с определенной площади колоний, что не давало возможности определить точное количество посевного материала.

Получение спорообразующего штамма 20-01 позволило оптимизировать процесс инокуляции вегетативной среды при использовании конидий [2].

Тестирование различных концентраций спор гриба в инокулюме показало, что оптимальной является концентрация  10⁶ спор на 1 мл вегетативной среды. Прорастаемость конидий штамма 20–01 составляла 80 – 85%.

На одном из заключительных этапов мутагенеза был получен новый спорулирующий мутант 21-34,способный  на оптимизированной среде продуцировать до 15 г/л компактина.