• Пигментный обмен

Пигментный обмен – совокупность сложных превращений различных окрашенных веществ веществ в организме.

Гематогенные (гемохромогенные) пигменты образуются в организме преимущественно при распаде и синтезе гемоглобина, в значительно меньшей степени - миоглобина, цитохромов и др.

• Химическое строение гемоглобина

• Схема распада Нв

Процесс распада начинается в сосудистом русле, завершается в клетках РЭС. Образуется комплекс Нв+гаптоглобин → разрыв связи между 1 и 2 пиррольными кольцами и переход Fe²⁺ в Fe³⁺ (протеолитическое действие β-цепи гаптоглобина) отличается особенностью – вердоглобин (глобин+разорванная система порфиринового кольца + Fe³⁺) → отщепление глобина и иона железа (глобин распадается до аминокислот, а железо переходит в форму ферритина), порфириновое кольцо разворачивается в цепь и формируется низкомолекулярный пигмент – биливердин → билирубин (под действием фермента биливердинредуктазы).

Общая схема распада Нв:

Нв →вердоглобин (окисленный гем+железо+глобин) →биливердин (без глобина и железа) → билирубин.

При распаде 1 г Нв образуется 34 мг БР.

• Билирубин

Постоянный компонент плазмы крови.

Имеет 4 изомера: α, β, γ, δ. У взрослых: 94% билирубина - α –изомер, 6% - остальные. У новорожденных 80% билирубина - α –изомер, 20% - остальные.

α –билирубин нерастворим в воде.

• Свойства свободного БР

• Высокая токсичность → вызывает разрушение мембран клеток.

• Липофильность → легко проникает внутрь митохондрий, вызывая разобщение окисления и фосфорилирования → при проникновении в клетки ганглиев головного мозга нарушает функции ЦНС (патогенез ядерной желтухи).

• Образует комплексы с альбумином и другими белками → резкое снижение биологической активности.

• Может вытесняться с молекулы альбумина лекарственными веществами, свободными жирными кислотами или др. → токсическое действие БР возрастает

NB! Не всегда имеется прямая связь между выраженностью желтухи и содержанием БР в крови. На проявления желтухи влияют особенности липидного, белкового обмена и другие факторы.

• Метаболизм свободного билирубина

Свободный БР → связывание с альбумином → доставка СБР в печень → диссоциация комплекса СБР –альбумин (на уровне поверхности наружной мембраны гепатоцитов) → активное перемещение СБР внутрь гепатоцита с участием полиферментной системы переноса, заложенной в мембране клетки (при поражении - с-м Жильбера, постгепатитная гипербилирубинемия Калька) → доставка СБР специальными белками-переносчиками к определенным структурам эндоплазматического ретикулума → конъюгация с глюкуроновой (УДФ-глюкуроновой) кислотой (при участии фермента глюкуронилтрансфераза) и серной (15%) → образуется СвБР = конъюгированный БР

• Свойства связанного билирубина

Это БР, конъюгированный с глюкуроновой кислотой.

• Не способен растворяться в липидном слое мембран

• Не проникает внутрь клеток и митохондрий

• Не токсичен

• Растворим в воде, легко выделяется с мочой

• Глюкуроновая кислота

Активные формы ГК - уридин-дифосфоглюкуроновая кислота (УДФ-ГК) постоянно образуются в клетках печени. Связывание УДФ-ГК и БР происходит по месту расположения остатков пропионовой кислоты БР. Таких остатков –2. Поэтому могут образовываться билирубин-моно и билирубиндиглюкурониды.

В клетках печени в норме и в плазме на 70% билирубиндиглюкуронидов приходится 30% билирубинмоноглюкуронидов. При воспалительных заболеваниях печени соотношение БР-ди и БР-моно смещается в сторону увеличения БР-моно.

Для исследования состава БР-глюкуронидов используются методы тонкослойной хроматограции, а также методы, основанные на различной растворимости БР-ди и БР-моно в органических жидкостях.

• Свойства фермента глюкуронилтрансфераза

Высоко чувствителен к содержанию в организме гормонов щитовидной железы→при гипертиреозе активность глюкуронилтрансферазы увеличивается, при гипотиреозе - снижается.

Активность глюкуронилтрансферазы увеличивается под влиянием небольших доз фенобарбитала

Имеются наследственные нарушения активности глюкуронилтрансферазы синдром Криглера-Найяра, Жильбера → накопление токсичного свободного БР в организме. Одновременно увеличивается содержание свободных форм стероидных гормонов, катехоламинов и других активных веществ.

• Транспорт и метаболизм связанного билирубина

БР-ГК активно против градиента концентрации перемещается через мембраны гепатоцитов в желчь с помощью специальных полиферментных систем (при их недостатке - синдром Дабина-Джонсона и Ротора) → поступление БР-ГК в просвет тонкого кишечника → превращение БР-ГК в свободный БР → мезоБР →мезобилиноген→уробилиноген → частично всасывается через слизистую тонкого кишечника → поступает в печень → возвращение вместе с желчью в просвет тонкого кишечника (энтеро-гепатальный круговорот).

N.B! Уробилиноген в общий ток кровообращения (и в мочу) в норме не попадает (подвергается распаду в печени с образованием дипирролов). Появление уробилиногена в моче является ранним (доклиническим) признаком поражения паренхимы печени.

• Распад уробилиногена в кишечнике

В просвете толстого кишечника уробилиноген восстанавливается в стеркобилиноген под действием кишечной флоры (при подавлении кишечной флоры антибиотиками, СА и другими препаратами этот процесс нарушается) → большая часть превращается в стеркобилин и выделяется из кишечника с калом → некоторое количество стеркобилиногена всасывается через слизистую оболочку толстого кишечника, попадая в систему нижней полой вены, минуя печень идет в почки и выделяется с мочой.

N.B! В норме в моче содержится стеркобилиноген (за сутки выделяется 1-6 мг у взрослых). Используемые в КДЛ методы не позволяют дифференцировать стерко- и мезобилиноген. Поэтому о наличии мезобилиногена в моче судят по возрастанию общего количества экскретируемых с мочой пигментов и с учетом клиники

• Определение уровня билирубина

В клинической практике определение БР в сыворотке применяют для решения следующих задач:

1. Выявление увеличенного содержания БР в тех случаях, когда при осмотре больного желтуха не выявляется или ее наличие вызывает сомнение.

2. Объективная оценка степени билирубинемии.

3. Дифференциальная диагностика различных видов желтух.

4. Оценка течения заболевания путем повторных исследований.

• Определение билирубина – преданалитический этап

• Липемия и гемолиз сыворотки искажают материалы исследования. Липемия приводит к ошибочно завышенному результату. Гемолиз сыворотки – ошибочно заниженные результаты.

• Материал нельзя держать на свету. Воздействие прямого солнечного света уже к исходу первого часа может снижать на 50% уровень БР(на этом основано фотолечение новорожденных).

• Проба должна анализироваться в течение 2 часов с момента взятия при хранении при комнатной температуре в темноте, или в течение 12 часов при хранении в холодильнике в темноте.

• Выражена интерференция лекарств - на общий БР- левомицетин, тетрациклин, аспирин, акрихина (за счет гемолиза), на конъюгированный БР - препараты, вызывающие холестаз: никотиновая кислота, а также пенициллин, эритромицин, СА, пероральные контрацептивы, эстрогены, андрогены, инсулин и др.

• Общий БР в сыворотке крови

Норма -3-20,5 мкмоль/л.

Метод Индрашика – цветная реакция с диазофенилсульфоновой кислотой (диазореактивом).

Прямые спектрофотометрические методы (λ=450нм) применяются как экспресс-методы для диагностики гипербилирубинемий новорожденных (у взрослых -интерференция небилирубиновых пигментов сыворотки (каротиноидов).

Неконъюгированный БР (гидрофобное вещество) дает трудную – непрямую реакцию с диазореагентом. Поэтому его называют непрямой. Конъюгированный БР (хорошо растворим в воде) дает быструю прямую реакцию с диазореактивом и называется прямой билирубин.

N.B! Неконъюгированный БР = непрямой БР

Конъюгированный БР = прямой БР

• Зависимость выраженности желтухи от концентрации БР

Конъюгированный и неконъюгированный БР обладают интенсивно красящей способностью. Появление желтухи отмечается при уровне БР 34 мкмоль/л и более. При концентрации общего БР до 85 мкмоль/л – легкая желтушность, 86-169 – средне-тяжелая, 170 и более – тяжелая.

• Определение конъюгированного и неконъюгированного БР

Прямой (конъюгированный) БР в сыворотке –норма – 0-3,4 мкмоль/л – определяют в прямой реакции с диазореактивом (розово-фиолетовое окрашивание). Позволяет проводить дифдиагностику желтух. Повышается при паренхиматозной и механической желтухе (одновременно несколько повышается и неконъюгированный). При гемолитической – не изменяется.

Непрямой (неконъюгированный) БР определяют расчетным путем - общий минус прямой. Норма – 3,4-16 мкмоль/л (составляет 75% от общего). Играет важную роль в диагностике гемолитических анемий.

• Определение содержания билирубина в моче

1. Качественные пробы (БР под действием окислителя превращается в изумрудно-зеленый биливердин). Проба Розина – наслаивают спиртовой раствор йода на мочу → при наличиии БР на границе – зеленое кольцо. Проба Гаррисона-Фуше – мочу смешивают с хлоридом бария, перемешивают, фильтруют, затем на фильтр наносят 2-3 кп реактива Фуше (водный раствор ТХУ с хлорным железом) → зеленое пятно.

2. Полуколичественные методы - сухая химия.

Норма – БР не определяется. Увеличение – при паренхиматозных и обтурационных желтухах (БР-ГУ).

• Определение содержания уробилиноидов в моче

Нормальные уробилиноиды в моче – это стеркобилиноген.

1. Качественные – проба Флоранса, проба Богомолова

2. Полуколичественные методы - тест-полоски (Кормэй, Лахема).

3. Количественные методы

Норма: следы уробилиноидов – у взрослых до 6мг/сут стеркобилиногена, у детей – до 2 мг/сут.

• Количественные методы определения уробилиноидов в моче

Метод Watson в модификации Henry: восстанавливают уробилиноген в уробилин с помощью аскорбиновой кислоты + реактив Эрлиха (диметиламинобензальдегид в концентрированной HCl) → фотометрия (562 нм).

N.B! 1. Мочу собирать в посуду из темного стекла, минимальный контакт с воздухом.

2. На результаты реакции влияет наличие билирубина в моче (удалить осаждением раствором хлористого бария), а также белка – создает мутность.

3. Идентичную окраску с реактивом Эрлиха дает порфобилиноген (необходимо предварительное разделение хлороформом - экстракция уробилиногена).

• Определение стеркобилиногена в кале

Определяют в водном экстракте кала аналогично определению уробилиноидов в моче (по Эрлиху).

Норма у мужчин 57-200 мг /сут, у женщин – 8-150 мг/сут. (75-350мг на 100 г кала независимо от пола).

Исследование целесообразно, если кал не имеет обычной окраски

• Желчные кислоты в сыворотке

В состав желчи входит 4 основные желчные кислоты: холевая (38%), хенодезоксихолевая (34%), дезоксихолевая (28%), литохолевая (2%). Образуются в печени из холестерина→ желчь → кишечник → всасывание → возврат в печень (печеночно-кишечная циркуляция желчных кислот).

Норма – 2,5-6,8 мкмоль/л.

Увеличивается при нарушении выделительной функции печени – при холестаз, поражении печени при алкоголизме, вирусном гепатите и др.

• Дифференциальная диагностика желтух по исследованию пигментного обмена

• Функциональные билирубинемии

Это нарушение пигментного обмена, связанные с наследственными или приобретенными изменениями процессов транспорта свободного и связанного БР через мембрану клетки и его глюкуронирования.

3 типа нарушений:

1. Нарушение транспорта свободного БР через мембрану гепатоцита - синдром Жильбера, постгепатитная гипербилирубинемия Калька

2. Отсутствие или снижение активности глюкуронилтрансферазы - синдром Криглера-Найяра, физиологическая желтуха новорожденных, гипербилирубинемия у детей от матерей, страдающих сахарным диабетом, гипотиреозом; синдром Ориеса-Люцея, лекарственная желтуха.

3. Нарушение транспорта БР-ГУ через мембрану в желчные ходы - синдром Дабина-Джонсона, синдром Ротора.

• Физиологическая желтуха новорожденных

Причина - инактивациея и выведение из организма новорожденного большого количества стероидных гормонов (инактивируются в печени за счет соединения с глюкуроновой кислотой→ конкуренция со свободным БР → относительная недостаточность системы глюкуронизирования). К 3-5 сут жизни экскреция стероидных гормонов в нормальных условиях завершается.

Физиологическая желтуха развивается у 86% доношенных новорожденных детей. Максимум – на 4-5 сутки, на 11-14 день – исчезает. Желтушность проявляется при концентрации БР ≥ 50 мкмоль/л (неконъюгированный БР + БР- моноглюкуронид).

• Физиологическая желтуха новорожденных при недоношенности

Причины:

• относительная недостаточность системы глюкуронидирования (см. выше)

• незрелость печеночной клетки

Поэтому степень билирубинемии и ее длительность во времени оказываются больше, чем у доношенных детей.

Патологические изменения у недоношенных – начиная от 170 мкмоль/л. Для предотвращения осложнений, связанных со свободным билирубином, важно определяют почасовый прирост БР (в норме 1,7-3,4 мкмоль/л/час).

≥ 5,1 мкмоль/л/час требуется проводить фототерапию

≥ 6,8 мкмоль/л/час – заменное переливание крови.

• Физиологическая желтуха новорожденных (продолжение)