9. Разрушение клеток с помощью химических веществ
ЛИ́ЗИС, растворение, разрушение клеток, в т. ч. микроорганизмов, под влиянием различных агентов, напр., ферментов, бактериолизинов, бактериофагов, антибиотиков. Так же клетки могут разрушаться под влиянием алкоголя.
Этиловый спирт является универсальным растворителем. Особенно хорошо спирт растворяет жиры из которых состоят оболочки клеток. Молекула спирта подходит к молекуле жира, взаимодействует с ней и вышибает оболочку клетки. Клетка повреждена. Цитолиз — процесс разрушения клеток эукариот выражающийся в виде их полного или частичного растворения под действием лизосомальных ферментов.
Выделяют следующие механизмы цитолиза.
1. Комплементзависимый цитолиз. После того, как антитела связываются с антигеном на поверхности клетки, происходит фиксация комплемента к Рс-фрагментам иммуноглобулинов. В результате активации комплемента мембрана антигеннесущей клетки перфорируется (в ней образуются отверстия) и клетка повреждается, а затем погибает.
2. Антителозависимый фагоцитоз. Связанные с антигенами антитела вызывают эффект опсонизации, т.е. облегчают фагоцитоз антигеннесущей клетки макрофагами (см. разд. 8).
3. Антителозависимая клеточная цитотоксичность. Уничтожение антигеннесущей клетки, связанной с антителами, может быть осуществлено К-лимфоцитами (киллерами), которые относятся к О-лимфоцитам и имеют рецепторы к Рс-фрагменту антител.
10. Методы определения белка в клетках микроорганизмов.
Для определения количества белка в образце используется ряд методик:
Биуретовый метод
Микробиуретовый метод
Метод Бредфорда
Метод Лоури
Спектрофотометрический метод
Биуретовый метод — один из колориметрических методов количественного определения белков в растворе. Мало используется в биохимической лабораторной практике (за исключением медицинских анализов на белок) из-за низкой чувствительности.
Принцип
Основан на образовании биуретового комплекса (имеет фиолетовый цвет) пептидных связей белков с двухвалентными ионами меди. В методе используют т. н. биуретовый реактив, состоящий из KOH, CuSO4 и цитрата натрия (или тартрата натрия). В образовавшемся комплексе медь связана с 4 азотами координационными связями, а с 2 кислородами — электростатическими. Полноценный комплекс образуется лишь с пептидами, состоящими более чем из 4 остатков. Оптическую плотность раствора (прямо
Микробиуретовый метод - метод основан на образовании окрашенного в фиолетовый цвет комплекса, образующегося в результате взаимодействия пептидных связей с Cu2+ в щелочной среде. К 0,2 мл ПМ лимфоцитов, сыворотки или плазмы добавляли 3,5 мл раствора NаОН и 0,2 мл реактива Бенедикта. Выдерживали 15 мин при комнатной температуре и спектрофотометрировали на СФ — 46 при 330 нм. Построение калибровочного графика проводили по стандартному раствору белка.
Метод Бредфорда — один из колориметрических методов количественного определения белков в растворе.
Принцип
Метод основан на реакции красителя кумасси (coomassie) с аргинином и гидрофобными аминокислотными остатками. Связанная форма имеет голубую окраску с максимумом поглощения при 595 нм. Таким образом увеличение адсорбции раствора при длине волны, равной 595 нм, пропорционально количеству белка в растворе.[2]
Метод даёт хорошее значение концентрации белка в пределах от 2 мкг/мл до 120 мкг/мл (в этих границах соблюдается линейная зависимость увеличения адсорбции от концентрации, в целом чувствительность метода зависит от соотношения концентраций определяемого белка и красителя: чем больше красителя, тем чувствительней метод), менее "капризный" по сравнению с методом Лоури.
Метод Лоури — один из колориметрических методов количественного определения белков в растворе. Предложен Лоури (Lowry) в 1951 году.
Принцип
В щелочной среде ионы Cu+2 образуют комплекс с пептидными связями, переходя в Cu+. Одновалентные ионы меди реагируют с реактивом Фолина (фосфомолибденовая кислота с фенолом), образуя нестабильный продукт, переходящий в молибденовую синь, с максимумом адсорбции при 750 нм. Увеличение адсорбции при 750 нм пропорционально концентрации белка. Метод очень чувствителен к наличию в растворе посторонних восстановителей (что затрудняет его использование при определении белка в неочищенных препаратах), чувствительность к белку - 10 - 100 мкг/мл.
Методы определения общего белка
Среди методов определения концентрации общего белка можно выделить несколько основных групп, основанных на различных принципах:
азотометрические;
гравиметрические (весовые);
«преципитационные»;
спектрофотометрические;
рефрактометрические;
колориметрические.
флюориметрические,
поляриметрические
атомно-абсорбционной спектрофотометрии
аминокислотного анализа белка.
Азотометрические методы
Азотометрические методы определения общего белка сыворотки основаны на определении количества белкового азота, образующегося при разрушении аминокислот, входящих в состав белков. Впервые метод был предложен Кьельдалем в 1883 году. В методе Кьельдаля, в настоящее время представляющем в целом исторический интерес, азот, содержащийся в составе белков, окисляют до иона аммония и его количество определяют титрованием точным раствором соляной кислоты. Кроме того, ион аммония может быть определен реактивом Несслера, манометрическим методом после превращения иона аммония в молекулярный азот под действием гипобромита или с помощью оптического теста Варбурга при участии фермента глутаматдегидрогеназы. Исходя из того, что белки из биологических объектов содержат в среднем 16 % азота, полученное в результате анализа количество азота умножают на коэффициент 6,25. Исторически используют фактор 6,25, хотя его величина зависит от белкового состава исследуемого образца. Для отдельных фракций белка в сыворотке или плазме величина фактора колеблется в диапазоне от 5,69 до 6,52.
Недостатком азотометрических методов является длительность и сложность процедуры, даже при том, что аммиак, образующийся в реакции, можно определять ферментативным методом. Автоматизация позволяет использовать этот метод в ряде случаев в качестве метода сравнения из-за его достаточной точности и воспроизводимости.
Гравиметрические методы
Гравиметрические (весовые) методы определения общего белка сыворотки основаны на высушивании белков до постоянной массы и взвешивании на аналитических весах. Методы трудоемки и в настоящее время практически не используются для определения общего белка сыворотки. Гравиметрический метод продолжает использоваться в некоторых лабораториях для определения фибриногена в плазме крови.
«Преципитационные» методы
«Преципитационные» методы определения общего белка основаны на снижении растворимости белков и образовании суспензии взвешенных частиц под воздействием различных агентов. О содержании белка в исследуемой пробе судят либо по интенсивности светорассеяния (нефелометрический метод анализа), определяемого числом светорассеивающих частиц, либо по ослаблению светового потока образовавшейся суспензией (турбидиметрический метод анализа).
Результаты данной группы методов зависят от множества факторов: скорости смешивания реактивов, температуры реакционной смеси, значения рН среды, присутствия посторонних соединений, способов фотометрии. Тщательное соблюдение условий реакции способствует образованию стабильной суспензии с постоянным размером взвешенных частиц и получению воспроизводимых результатов. «Преципитационные» методы для определения белка в сыворотке крови не получили признания и нашли применение при определении белка в моче, спинномозговой жидкости и многих индивидуальных белков с использованием специфических антител.