99 кругов АДА

гидридизации могут быть четко дифференцированны нормальные гомозиготные индивиды, гетерозиготы и гомозиготы по серповидно клеточной мутации.

Аллель-специфическая амплификация нормальной и мутантной ДНКпоследовательности можно рассмотреть на одной из основных мутаций в гене фенилаланингидроксилазы, приводящей к фенилкетонурии.

Для исследования используют два ДНК-праймера, фланкирующих исследуемый 12-ый экзон гена (праймеры А и В), а также олигонуклеотидные праймеры, комплиментарные нормальной (праймер S) и мутантной последовательности (праймер М) в локусе 408. Амплификация с различными комбинациями четырех праймеров позволяет в одном эксперименте определить нормальное состояние обоих аллелей, гетерозиготное носительство мутации R408W и гомозиготу по мутации R408W в гене фенилаланингидроксилазы

55. Методы анализа конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК и гетеродуплексного анализа.

SSCP-анализ – основывается на различной подвижности однонитиевых ДНК-структур в неденатурирующем ПАА, зависящей от их первичной нуклеотидной последовательности. Анализируемый фрагмент амплифицируется в ходе ПЦР. Затем продукт реакции подвергается термической денатурации (+95 градусов цельсия) в присутствии формамида и быстрому охлаждению, препятствующему реассоциации нитей ДНК. Далее проводится электрофорез в ПАА и подвижность исследуемой сравнивается с аналогичными нормальной вариантов денатурированной ДНК. Наличие даже одной точечной мутации приводит к изменению подвижности, вследствие изменения вторичной структуры фрагментов ДНК в геле.

Гетеродуплексный анализ фрагментов ДНК также позволяет выявить мелкие (нуклеотидные) мутации в последовательностях ДНК.

При данном подходе анализируемый фрагмент гена амплифицируется в реакции ПЦР, а затем создаются условия для образования гетеродуплексов между различными аллелями, имеющими единичные расхождения в последовательности нуклеотидов. Для этого амплификаты денатурируют при 95 градусах, а затем медленно охлаждают.

При этом происходит реассоциация молекул ДНК, в том числе двойные цепи ДНК образуются не только между идентичными однонитиевыми фрагментами, но и не полностью комплиментарными ДНКпоследовательностями. Так, при наличии в смеси ПЦР-продуктов разных

аллелей они формируются между диким типом и мутантной ДНК. Гетеродуплексы имеют меньшую подвижность.

Преимущества: высокая чувствительность, быстрое обследование на наличие потенциальных мутаций в различных областях исследуемых генов.

56. Патологическая анатомия генома человека. Картирование генов человека. Функциональное, кандидатное, позиционное и позиционнокандидатное картирование. Картированные гены и признаки человека.

Картирование генов - определение положения данного гена на какой-либо хромосоме относительно других генов.

Генетическое картирование основано на определении групп сцепления, частоты рекомбинации и построении генетических карт, где единицей измерения служат проценты рекомбинации, или сантиморганы (сМ).

Цитогенетическое картирование осуществляется с применением методов цитогенетики, когда для локализации каких-либо нуклеотидных последовательностей и определения их взаимного расположения используются цитологические препараты

Физическое картирование обширная группа методов, позволяющая строить карты генома и определять расстояния между локализуемыми нуклеотидными последовательностями с точностью от нескольких десятков тысяч п.н. до одной нуклеотидной пары.

Этапы функционального картирования:

1.определение аминокислотной последовательности белка (или выделение мРН К) и реконструкция кДН К; синтез олигонуклеотидного зонда и скрининг кДНК-библиотек для выделения кДНК-клона;

2.установление хромосомной локализации гена-мишени (методом гибридизации in situ или др.);

3.скринирование контигов, охватывающих район локализации генамишени, для определения клонов, гибридизующихся с данным кДНКклоном;

3.секвенирование позитивных клонов и характеристика гена-мишени (выявление мутаций)

Кандидатное картирование:

Информация о функциональном изменении недостаточно полна, чтобы точно указать ген, однако достаточна для того, чтобы выдвинуть обоснованные предположения о возможных кандидатах либо по их функции, либо по положению на хромосоме.

Локализовать ген - пройти путь от его функции к локализации на хромосоме

Позиционное картирование:

устанавливается локализация гена при отсутствии всякой функциональной информации о нем место гена на карте устанавливают по результатам анализа сцепления гена

с ранее локализоваными генетическими маркерами детально исследуется область генома рядом с маркером.

57. Генетика мультифакторных заболеваний. Главные гены. Полигены. Генотип и среда.

Мультифакториальные болезни - это болезни, которые развиваются в результате взаимодействия определённых комбинаций аллелей разных локусов и специфических воздействий факторов окружающей среды.

Модель причин МФЗ: мультифакториальное наследование – средовые факторы, случайные факторы и совокупность генетических факторов (главные гены и полигены)

Полигены - неаллельные гены, влияющие на проявление количественных признаков.

-гены, контролирующие выражение признака, качественное изменение его характеристик.

-набор генов слабого действия, каждый из которых вносит небольшой вклад в проявление количественного признака.

Главные гены – ген с четко проявляемым фенотипическим эффектом в противоположность полигену. Различие между типом их действия. Олигогены не действуют раздельно, а проявляют эффект как часть общей генетической системы.

Генотип – совокупность генов данного организма, которая характеризует особь (в отличие от генома, который характеризует вид в целом)

58. Проблемы генетического картирования мультифакториальных заболеваний и сложно наследуемых признаков.

1.Неполная пенетрантность. Не все носители мутантного генотипа проявляют фенотип, отличный от нормы.

2.Наличие фенокопий (имитация генетического эффекта). Проявление мутантного фенотипа у носителей нормального генотипа по причинам негенетического характера.

3.Генетическая гетерогенность. Один и тот же фенотип может быть результатом различных мутаций.

4.Полигения (генетические взаимодействия). Клинический фенотип м.б. результатом действия многих генетических локусов.

5.Очень низкая частота аллеля, связанного с заболеванием.

6.Высокая частота в популяции аллеля, связанного с болезнью.

7.Неменделевские механизмы передачи генетической информации (митохондриальное наследование, экспансия числа тринуклеотидных повторов, геномный импринтинг).

59. Подходы к картированию мультифакториальных заболеваний и сложно наследуемых признаков (метод IBD, анализ ассоциации)

Метод идентичных по происхождению аллелей (IBD –Identical by descent) заключается в оценке того, насколько часто по сравнению со случайной сегрегацией пара больных родственников наследует одну и ту же (идентичную по происхождению) копию участка генома.

Анализ общих по происхождению аллелей возможен для любых пар близких родственников, однако на практике чаще всего используют пары больных сибсов.

IBD –анализ в сибсовых парах называется ASPметод (affected sibpairs).

Методом IBD был картирован

один из локусов диабета типа I на хр.11,

показано сцепление гипертензии с геном ангиотензина, ревматоидного артрита с геном HLA,

поздняя форма болезни Альцгеймера с локусом на хр.19, гомосексуальной ориентации – с регионом Хq28.

Анализ ассоциаций - сравнение больных индивидов со здоровыми из той же популяции.

Основан на поиске корреляций в частотах аллелей

Генетический маркер (аллель данного гена) считается ассоциированным с болезнью, если его частота среди больных значимо выше, чем в контрольной выборке.

Материалом для исследования анализа служат независимые группы больных и здоровых людей.

60. Рутинная и дифференциальная окраска хромосом. Методы дифференциального окрашивания. Цитогенетическая номенклатура. Система символов обозначения кариотипа.

Классификация хромосом:

Денверовская (1960) – сплошное окрашивание, характеризует количество, размер, форма в итоге имеем 7 групп хромосом по величине и расположению центромеры А (1-3) большие метацентрики

B (4,5) крупные субметацентрики

C(6-12, Х) средние субметацентрики

D(13-15) большие акроцентрики

E(16-18) короткие субметацентрики

F(19,20) малые метацентрики

G(21, 22, Y) малые акроцентрики

Метацентрики – равноплечие, субметацентрики – неравноплечие, акроцентрики – хромосома, у которой центромера сильно смещена к одному из концов)

Парижская (1971) – дифференциальное окрашивание, в итоге выяснено, что каждая хромосома имеет свой неповторимый рисунок – хромосомы индивидуализированы

Виды окрасок хромосом:

Рутинная (полностью всю в один цвет, используется в Денверовской классификации)

Дифференциальная

FISH-метод (больше цветов нежели в дифф)

Р – короткое, q – длинное плечо, делится на регионы, а регионы на сегменты

61. Синдромы, проявляющиеся хромосомной нестабильностью (анемия Фанкони, атаксия телеангиэктазия, синдром Блюма, синдром Вернера, Нийгемена, Робертса)

Хромосомная нестабильность – одно из проявлений нестабильности генома на клеточном уровне Оценивают по увеличению спонтанной или индуцированной частоте

хромосомных абберраций и сестринских хроматидных обменов (СХО)

В основе данного явления чаще всего лежат дефекты генов, кодирующих ферменты репарации ДНК. Поэтому большинство болезней, сопровождающихся хромосомной нестабильностью, называют ещё болезнями репации ДНК.

Общие признаки болезней репарации:

1.Повышенная склонность к злокачественным образованиям

2.Признаки преждевременного старения

3.Неврологические расстройства

4.Иммунодефицитные состояния

5.Врожденные пороки развития

6.Кожные проявления

7.Умственная отсталость различной степени проявления

Анемия Фанкони: микрофтальмия, микрогнатия, панцитопения, гипоплазия лучевой кости и большого пальца, задержка роста и развития Гиперпигментированные пятна на коже в подмышечных и паховых областях Склонность к лейкозам,гипоплазия наружных половых органов, крипторхизм

Низкая концентрация IgAs На микро: КВАДРИАЛЫ

Атаксия-телеангиэктазия или синдром Луи-Бар Мозжечковая атаксия, телеангиэктазии на конъюктиве, открытых участках тела и слизистой оболочки неба, нистагм Прогрессирующая мышечная атрофия Гипоплазия тимуса, умирают от легочных инфекций Виноваты 7 и 14 хромосомы:транслокации в них

Синдром Блюма: эритрема на узком лице в виде «бабочки», низкий вес при рождении, задержка роста, снижение функциональной активности Т-лф и снижение уровня IgMs

Умственная отсталость не во всех случаях Увеличение СХО до 120-150 (при N: 6-8) на 1 клетку

Хроматидные разрывы, дицентрики, кольца и хромосомные фрагменты

Синдром Вернера: преждевременное старение, низкий рост, тонкие, редкие и седые волосы, облысение, крючковатый нос, атрофия подкожной жировой клетчатки и мышечной ткани Сахарный диабет

Бесплодие, гинекомастия, аменорея, высокий голос, редко доживают до 40 лет

Клеточные клоны с хромосомными транслокациями, ген в 8p11

Синдром Нийгемена: задержка роста, микроцефалия, иммунодефицит, пятна на коже цвета «кофе с молоком» Выраженная умственная отсталость

Цитогенетически характеризуется повышенной частотой хромосомных аномалий с преимущественным поражением хромосом 7 и 14

Синдром Робертса: дефекты верхних и нижних конечностей (от редукции до фокомелии), выражена расщелина губы и неба, микроцефалия, редкие серебристо-белые волосы, деформированные ушные раковины Двурогая матка, поликистоз почек.

Большинство рождаются мертвыми или погибают в неонатальный период Описаны редкие взрослые больные Митотеский мутант, преждевременное расхождение хроматид в

центромерных районах и разрыхление центромер

62. Классификация и общая фенотипическая характеристика хромосомных болезней. Популяционная частота и основные группы риска хромосомной патологии.

Хромосомные болезни – это большая группа врожденных наследственных заболеваний, клинически характеризующихся множественными внутренними пороками развития

Популяционная частота – 0,6-1%

Классификация:

Болезни обусловленные нарушением числа хромосом (25% - аутосомные трисомии, 35% - нарушение половых хромосом)

Болезни, связанные с нарушением структуры хромосом – 40% (в том числе, обусловленные и микроаномалиями хромосом)

Болезни проявляющиеся хромосомной нестабильностью

Диагностические признаки хр.синдромов:

1.Признаки, позволяющие заподозрить аномалии хромосом (психическое и физическое недоразвитие, черепно-лицевые дизморфии, пороки внутренних органов)

2.Признаки, чаще всего встречающиеся при определенных синдромах (с.Эдвартса – долихоцефалия и флексорное сгибание кисти)

3.Признаки, патогномичные для определенного синдрома (кошачий крик при делеции 5р)

63. Числовые нарушения хромосом. Понятие мозаицизм.

Нарушение числа хромосом:

Анеуплоидия – изменение (↑ - трисомия, ↓ - моносомия) числа хромосом в ДИПЛОИДНОМ наборе, некратное гаплоидному (2n+1, 2n-1) Полиплоидия – увеличение числа наборов хромосом, кратное гаплоидному

(3n, 4n, 5n и т.д.)

Мозаики – особи, в организме которых имеются несколько клонов клеток с различным кариотипом.

Наличие в организме, развившемся из одной зиготы, двух/более клеточных линий с различным хромосомным набором – хромосомный мозаицизм Хромосомный химеризм – наличие в организме, сформировавшемся вследствие объединения двух зигот или бластомеров из разных зигот, нескольких клеточных линий с различным хромосомным набором.

Типы мозаицизма:

1.Плацентарный (морула, ограничен хорионом).

2.Тканевой (бластула, ограничен одним зародышевым листком).

3.Истинный (генерализованный), (образуется на стадии зиготы).

Возникновение мозаицизма является следствием нарушения митотической сегрегации хромосом (нерасхождение или анафазное отставание) на постзиготических этапах развития.

Возникновение мозаицизма является следствием нарушения митотической сегрегации хромосом (нерасхождение или анафазное отставание) на постзиготических этапах развития.

Влияние мозаицизма на развитие организма зависит:

от характера хромосомного нарушения, вовлеченного в мозаичное состояние; от частоты клеточного клона с хромосомной аномалией;

от распределения клеточных клонов с хромосомным нарушением в производных различных зародышевых листков.

64. Хромосомные болезни, обусловленные структурными мутациями хромосом. Частично моно- и трисомии.

Синдром трипло-Х, 1:1000 – нормальное развитие, чем больше Х тем, больше отклонение от нормы

Кляйнфельтера: полисомия 47, ХХУ

Синдром Шершевского-Тернера (45, Х) – короткая шея с крыловидными складками единственная моносомия, не менее 90% зачатых абортируются спонтанно

Гипогонадотропизм, недоразвитие половых органов, врожденные пороки развития, низкий рост, отсутсвие гонад, гипоплазия матки, маточных труб, первичная аменорея

По 8ой: полная летальна, 1:50 000, у мальчиков больше чем у девочек (5/2) Выступающий лоб, косоглазие глубоко посаженные глаза, гипертелоризм глаз и сосков, эпикант, аномальная ушная раковина, контрактура межфаланговых суставов, вывернутая нижняя губа, оттопыренные уши Умственная отсталость

По 9ой: задержка умственного и физического развития, микроцефалия, бульбообразной фор­мы нос, микрогения, ретромикрогнатия, деформированные низкорасположенные ушные раковины.

Вывих бедер, аномальное положение пальцев рук. камптодактилия, косолапость, контрактура крупных суставов.

У мальчиков - гипоплазия полового члена и мошонки, крипторхизм.

По 13ой: синдром Патау: двухстороняя расщелина губы и неба

1:5000-7000

Гексодактилия, флексорное положение кисти, хобот, сглаженный фильтр, оттопыренная нижняя губа

По 14ой: микроцефалия, асимметрия лица, высокий и выступающийлоб, нос короткий и бульбообразный, губы полные, высокое небо, часто с расщелинами, микроретрогнатия. Ушные раковины низко посажены, с маленькими мочками. Короткая шея, узкая и деформированная груд­ная клетка, крипторхизм, гипогонадизм и маленький пенис. Из поро­ков внутренних органов выражены пороки сердечно-сосудистой сис­темы,