Ход работы

2. Получение клеточного экстракта дрожжей

Цитохром Р₄₅о является внутриклеточным белком. Чтобы его выде­лить, необходимо разрушить клетки. Для этого клетки дрожжей, отмытые от среды, тщательно растирают в ступке с кварцевым песком, после чего экстрагируют белки дистиллированной водой (из расчета 5 мл воды на 1 г сырой биомассы).

Неразрушенные клетки и осколки клеточных стенок удаляют цен­трифугированием при 14 тыс. об/мин в течение 15 мин.

В полученном клеточном экстракте определяют концентрацию об­щего белка и концентрацию иитохрома Р_4?о.

Для выполнения работы но фракционированию белков достаточно знать концентрацию белков в условных единицах, например, в единицах оптической плотности. Поэтому концентрацию общего белка и цигохрома Р45о можно определить спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность клеточных экстрактов при длинах волн 280 нм (соответствует максимуму поглощения пептидных связей белков! и 450 нм (соответст­вует максим\му Hoi лощения железопорфирина в цитохромс Р,₅„).

3. Фракционирование клеточного экстракта

Фракционирование производят в соответствии со схемой, представ­ленной на рис. 3.

Клеточный Измерить:

• Экстракт объем. ОДгяо- ОД450

Осажление сульфа­том аммония. 25% насыщения

Центрифуги­

рование

г~

• 

  Осадок 1

  Раствор 1

Измерить:

ОД280, O/Uso

■ Супернатант 1

Осаждение сульфа­том аммония. 50%	. 11ентпиг1ши-
		|рование
насыщения		•1_

• 

  Осадок 2■

  Раствор 2

Изменить:

ОДгво, О/Ьяо

Супернатант 2

		Центрифуги­ рование
том аммония. 75% 1
насыщения

Осадок 3

• Раствор 3

Измерить:

ОД:»п, ОД 4м|

Супернатаит3

Рис. 3. Схема фракционирования клеточных экстрактов дрожжей

а) К полученному клеточному экстракту добавляют сульфат аммо­ния до 25% насыщения. Тщательно перемешивают и оставляют на 10 ми- нут(формирование осадка). Образовавшийся осадок белков отделяют цен­трифугированием при 6-8 тыс. об/мин в течение 10 минут. Полученный осадок 1 растворяют в 5 мл дистиллированной воды и измеряют в этом растворе концентрацию цитохрома Р₄₅₀ и концентрацию общего белка. Значения ОД450 и ОД₂8о с учетом возможных разведений записывают в таблице .

б) К супернатанту I добавляют сульфат аммония до 50%-ного на­сыщения и отделяют белки как написано в п.1. Осадок 2 белка растворяют в 5 мл. Измеряют концентрацию цитохрома Р₄*, и общего белка. Получен­ные данные вносят в табл. I.

в) Проводят дальнейшее фракционирование супернатанта 2 при 75%-ном насыщении сульфата аммония.

Полученный осадок 3 растворяют в 5 мл дистиллированной воды и измеряют концентрацию цитохрома P₄s,i и общего белка. Данные записы­вают в табл. .

Результаты фракционирования экстракта

и

1» с- ! — 2- ⁴

о Ю ^ о

<L> о

Е ^с-

й 5

x.-i

Стадия очистки

i Получение клеточного экстракта

¹ Получение осалка 1 ^: Получение осадка 2 Получение осадка 3