5. Определение объемов элюции калибровочных белков

После определения свободного объема через колонку последова­тельно пропускают растворы белков - маркеров. В качестве маркеров предлагается использовать:

Белок-маркер	Молекулярная масса
j Яичный альбумин	45000
; Бычий сывороточный альбумин	68000
Алкогольдегидрогеназа из	37000
дрожжей
Лизоцим	13930
Рибонуклеаза из поджелудочной	12700
железы

В колонку вносят 100-200 мкл 0,1% раствора белка-маркера. Белки удобно наносить в порядке уменьшения их молекулярной массы с интер­валом, зависящим от размеров колонки. Для колонки размером 1,0 35 см он равен 10 мл. Во время нанесения белков колонку перекрывают. Элюат, вытекающий из колонки со скоростью 15-20 мл/ч, собирают порциями по 1 мл.

В собранных фракциях определяют содержание белка спектрофото­метрически при 280 нм. Перед определением каждую фракцию разбавляют в 3 раза, добавляя по 2 мл чистого элюента.

Строят профили элюирования белков-маркеров и оценивают их объ­емы элкжии.

6. Определение объема элюции исследуемого белка

На колонку наносят 100-200 мкл раствора исследуемого белка и со­бирают фракции по 1 мл. Фракции разбавляют в 3 раза и оценивают в них

мжиешрацию белка при 280 нм. Строят профиль элюции, по которому ощн-делиют V,.

h. Определение молекулярной массы исследуемого белка

1’ассчитывают величины К_а и строят калибровочный график, по ко- ырому определяют молекулярную массу яичного альбумина.

Техника безопасности

При работе на установке соблюдать правила работы со стеклом. Пе­рги ПК точением перистальтического насоса проверить исправность розет­ки шпура, вилки, а также наличие заземления. При выполнении измерения 1ЧИИЧССКОЙ активности руководствоваться инструкцией по работе со спек- фофоIокалориметром (документация на рабочее место № 3).