II.Материалы и методы

2.1. Материалы.

В эксперименте использовались плодовые мухи Drosophila melanogaster (Meigen, 1830). Линии мух, используемые в эксперименте, и их характеристики представлены в таблице 2.1.

Табл. 2.1 Линии мух и их характеристики.

Линия	Характеристика линии	Генетический маркер
MS(145)	flamenco־, наличие активной копии gypsy	w^1
SS (7K)	flamenco־, активный gypsy отсутствует	w^1
SS (C3(19))	flamenco^+	w^1

2.2. Методы

2.2.1. Методы компьютерного анализа.

Для анализа нуклеотидных последовательностей использовали компьютерную программу Vector NTI 9.

2.2.2. Выделение тотальной рнк из мух.

Тотальную РНК выделяли согласно протоколу набора “Promega” “RNAgents Total RNA Isolation System”.

1. Мух в количестве 40 штук помещали в пробирку объемом 1,5 мл, пробирку взвешивали.

2. Гомогенизировали биологический материал с помощью тефлонового пестика до получения однородной массы в присутствии Denaturing Solution (300 мкл на 30мг навески).

3. Добавляли 2М ацетат натрия до получения pH раствора 4, перемешивали раствор.

4. Добавляли смесь фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (1:1:1) к раствору в соотношении 1:1, тщательно перемешивали в течение 10 секунд и инкубировали на ледяной бани 15 минут.

5. Центрифугировали 20 минут при 10 g при температуре 4˚С, отбирали верхнюю фазу.

6. Добавляли один объем изопропанола, перемешивали и инкубировали 30 мин при температуре -20°С.

7. Центрифугировали 10 минут при 10 g, отбирали супернатант, добавляли 1 мл охлажденного 70% этанола.

8. Центрифугировали 10 минут при 10 g, отбирали супернатант, просушивали осадок и растворяли его в небольшом количестве воды Nuclease Free Water в зависимости от величины осадка (10-40 мкл).

9. Концентрацию РНК измеряли с помощью спектрофотометра (фирма «Nanodrop»), качество оценивали в 3 % агарозном гель - электрофорезе.

2.2.3. Синтез кДнк.

Синтез кДНК делали по протоколу набора фирмы “Fermentas” “First Strand cDNA Synthesis Kit”.

1. РНК обрабатывали DNase I (“Fermentas”) в двойном объеме для удаления ДНК в растворе. Состав смеси показан в таблице 2.2

Табл. 2.2 Состав смеси для обработки DNase.

Название	Концентрация, активность, количество, кратность в растворе
РНК	1000 ng
Буфер для Dnase I c MgCl2 (“Fermentas”)	1X
Dnase (“Fermentas”)	1U

Табл. 2.3. Состав 10X буфера для DNaseI («Fermentas»)

Название	Концентрация в растворе
Tris-HCl (pH 7,5)	100 mM
MgCl2	25 mM
CaCl2	1 mM

2. Инкубировали смеси при температуре 37°С 1 час.

3. Добавляли к смеси EDTA до конечной концентрации в растворе 2,27 мМ для ингибирования DNase I, перемешивали, инкубировали при температуре 65°С 10 минут.

4. К раствору РНК добавляли Random Primer, перемешивали и инкубировали при 65°С 5 минут, затем охладили на льду (см. табл.2.4).

5. Добавляли dNTP, ингибитор RNase Ribolock, реакционный буфер, обратную транскриптазу (см. табл. 2.4).

Табл. 2.4 Реактивы для обратной транскрипции.

Название	Концентрация, активность, количество в растворе
РНК	1000 ng (50 ng/µl)
Random primer	5µM
dATP	0,5 mM
dTTP	0,5 mM
dCTP	0,5 mM
dGTP	0,5 mM
RiboLock	20 U(20 u/µl)
Reaction buffer	1X
Ревертаза	20 U

Табл.2.5 Состав 5X Reaction buffer

Название	Концентрация, активность, количество в растворе
Tris-HCl (pH 8,3)	250 mM
KCl	250 mM
MgCl2	20 mM
DTT	50 mM

6. Инкубировали при 25°С 5 минут, затем при 37°С 1 час, затем при 70°С 10 минут.