2.2.4. Полимеразная цепная реакция, совмещенная с обратной транскрипцией

ПЦР проводили в амплификаторе «Amply 4» фирмы «Biokom».

Состав смеси ПЦР представлен в таблице.

Табл.2.6 Состав смеси для ОТ- ПЦР

Название	Концентрация, активность, количество в растворе
Taq Buffer (+(NH4)2SO4,-MgCl2) («Fermentas»)	1X
dATP	0,2 mM
dCTP	0,2 mM
dGTP	0,2 mM
dTTP	0,2 mM
MgCl2	2,5 mM
Primer f	0,4µM
Primer r	0,4µM
кДНК	100 ng
Taq Polymerase	2,5 U

Табл.2.7 Состав 10Х Taq Buffer.

Название	Концентрация в растворе
Tris-HCl (pH 8,8)	750 mM
(NH4)2SO4	200 mM
Tween 20 (v/v)	0,10%

Для предотвращения испарения ПЦР-смеси поверх нее капали 30 мкл минерального масла.

Параметры ПЦР, использованной во время постановки ПЦР:

1. Денатурация ДНК: Т=95^оС, 2 мин

2 .1. Денатурация ДНК: Т=95^оС, 30 сек

2.2. Отжиг праймеров: Т=54^оС, 1 мин 30 циклов

2.3. Синтез: Т=72^оС, 1 мин

3. Синтез: Т=72^оС, 3 мин

Праймеры для ПЦР подбирали с помощью программы VectorNTI 9 (табл.2.8).

Табл. 2.8 Праймеры, использованные в ОТ - ПЦР.

Название	Последовательность 5’-3’ 5’-3’	Температура отжига	Размер продукта
ZAM_RT_f	aacggcatcaattgcatcaa	54	513
ZAM_RT_r	tgttggttctactctgcttg	54
17.6_RT_f	cctgcgtagcacgattttgt	54	536
17.6_RT_r	ctatgtccgccacaccagtt	54
297_RT_f	cgttggttcatacgccgaat	54	511
297_RT_r	ttcgacgtctgctactccgt	54
Transpac_RT_f	taacaagcgatccgatagtc	54	600
Transpac_RT_r	ctgagtccgcactgtgaata	54
Tirant_RT_f	ВПИШИ ПРАЙМЕРЫ	54
Tirant_RT_r	ВПИШИ ПРАЙМЕРЫ	54
Springer_RT_f	gacgtagttcgacagtttcc	54	500
Springer_RT_r	gccactattgtctgcgattt	54
Rover_RT_f	gcgacttaatagggttgtcc	54	494
Rover_RT_r	ttccgtgttacggtgttctg	54
Quasimodo_RT_f	gtagtagagactggctggaa	54	623
Quasimodo_RT_r	ttcgggagttgagctggaat	54
Opus_RT_f	ggaagcacatttgcaacgct	54	531
Opus_RT_r	ttgagcactgtggggcataa	54
Idefix_RT_f	gacatgggaaaaccgcaaga	54	500
Idefix_RT_r	acgatcttcctgccacgatt	54
Gypsy_RT_f	gtgaacgctattcactgcga	54	548
Gypsy_RT_r	gaggtgacagtttctgagtt	54