4. Библиотеки днк

Геномная библиотека. Если геном какого-либо организма разрезать, вставить в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку, то в таком виде его можно сохранить. При разрезании плазмидной или фаговой ДНК вероятность выпадения целых и неизмененных кусков генома довольно высока. Такой способ получения геномной библиотеки получил название «метод дробовика», так как геном в данном случае представлен отдельными фрагментами. Принципы создания плазмидных и вирусных векторов общие, поэтому рассмотрим их на примере плазмидных. Следует отметить, что из вирусных ДНК лучше использовать ДНК фагов, так как они имеют большую емкость и позволяют вставлять более крупные куски генома.Очищенные кольцевые молекулы ДНК обрабатывают рестриктазой, получая линейную ДНК. Клеточную ДНК обрабатывают той же рестриктазой, добавляют к плазмидной, добавляют лигазы. Таким образом получают рекомбинантную плазмидную ДНК, которую вводят в бактериальные или дрожжевые клетки. Плазмида реплицируется с образованием многих копий. Многие плазмиды несут ген устойчивости к антибиотикам, и если в рекомбинантной плазмиде есть такой ген, то клетки легко выявлять, выращивая на среде с антибиотиком.Каждая такая колония представляет собой клон или потомство одной клетки. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а совокупность плазмид можно назвать библиотекой геномной ДНК. Недостаток такого метода в том, что фрагменты ДНК образуются в огромном количестве. Разрезание геномной ДНК определяется случаем, поэтому лишь часть фрагментов содержат полноценные гены. Некоторые фрагменты могут содержать только часть гена или же интронные последовательности.Существует 2 варианта конструирования этих библиотек :

• In Vivo –характерно для методик I поколения, ПРЕИМУЩЕСТВА: библиотеки созданные in vivo можно использовать и для др. вещей , например в картировании геномов

Относят иерархический подход

• In vitro -характерно для методик II поколения, удобнее использовать

Относят шотган –подход

При конструировании геномных библиотек используют фаговые и плазмидные вектора:

Плазмиды

1. рUC. 90% сиквенсов делается на этой плазмиде.

2. В очень редких случаях берется какой-то другой вектор, но такого же типа – небольшая высококопийная бактериальная плазмида. Используется она, т.к. это высококопийная плазмида, присутствует в клетке до 1000 копий, ее легко выделить и концентрация ее в препарате высокая, поэтому легко очищать.

Недостатки, связанные с высокой копийностью:

1. Некоторые фрагменты геномной ДНК в принципе невозможно клонировать в таких плазмидах, т.к. даже нормальный клеточный ген может оказаться токсичным для клетки.

2. В такие векторы нельзя клонировать протяженные фрагменты ДНК длиной больше нескольких т.н.п.

Фаговые векторы

У них всегда больше емкость; Считается, что фаговые векторы замещения достаточно стабильны, и их до сих пор используют в крупных геномных проектах, когда нужно закрыть пробелы, которые никак не клонируются в других библиотеках.

1. Недостатки:

ДНК фага выделять гораздо менее удобно (сложнее методика, гораздо более трудоемко, автоматизировать сложнее). Поэтому фаговые векторы обычно используются на стадии финиширования, когда нужно закрыть пробелы.

• Следующий по емкости – космидный вектор. Это гибрид плазмиды и бактериофага

• Следующие по времени разработки векторы – это дрожжевые искусственные хромосомы. Эти векторы специально разработаны под проект «Геном человека». Искусственные хромосомы – линейный фрагмент ДНК, который должен нести 3 составных части. Как правило, такая дрожжевая хромосома имеет точку инициации репликации плазмид, для того чтобы нарабатывать ДНК в бактериях.

• искусственные хромосомы на основе фага Р1. Это крупный фаг, более 100 т.н.п. В клетке он существует в виде плазмиды, не встраиваясь в хромосому. Может быть лизогенным. Это природная плазмида, рассчитанная на подержание достаточно крупного репликона.

6.Первое поколение методик секвенирования ДНК

Основные принципы:

1.Создается набор коротких фрагментов ДНК,один из концов которых идентичен для всех фрагментов,а второй варьирует и соответствует всем возможным позициям одного из 4 нуклеотидов.

2.Электрофорезом в полиакриламидном слое с точностью до 1 нуклеотида определяется длина полученных фрагментов.

3.Считывание последовательности производится путем сопоставления размеров фрагментов,соответствующим позициям каждого из 4 нуклеотидов.

4.Оригинальные методики использовали радиоактивные метки,,радиоавтографию и «ручное»прочтение последовательности ДНК,более поздние- флуоресцентные метки и автоматическое считывание последовательности ДНК.

Достоинства:

-предельная простота

-дешевизна

-наглядность

Недостатки:

-высокая трудоемкость

-ограниченное разрешение геля

Наиболее успешный классический метод секвенирования основан на испольтзовании дидезоксинуклеотидов,после включения которых дальнейший синтез ДНК невозможен.

Перед секвенирование по методу Сенгера,молекулу ДНК разрезают на фрагменты и клонируют в Escherichiacoli. Выделенные из бактериальных клеток фрагменты многократно амплифицируют(увелич. Кол-во) с помощью полимеразной цепной реакции(ПЦР). ПЦР состоит в следующем. Образец ДНК нагревают до температуры,при которой происходит расхождение цепей. Затем в реакционную смесь добавляют дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP) и праймер – короткийолигонуклеотид, комплиментарный небольшому сегменту ДНК-матрицы. Он гибридизуется с этим сегментом и ДНК-полимераза последовательно присоеденяет к его концу дезоксинуклеозидтрифосфаты, комплиментарные нуклеотидам копируемой цепи. Процесс многократно повторяют, пока не получат миллионы копий каждого фрагмента. Раствор с одноцепочечными фрагментами и праймерами распределяют по 4 пробиркам, в каждую из которых добавлены 4 разные дезоксинуклеозидтрифосфаты и один из флуоресцентно меченных дидезоксинуклеозидтрифосфатов. Удлинение гибридизовавшегося с ДНК-фрагментом праймера происходит до тех пор,пока в цепь не включится дидезоксинуклеозидтрифосфат. В этом месте синтез останавливается и в результате в каждой из пробирок образуется уникальный набор отрицательно заряженных фрагментов разной длины, оканчивающихся одним из меченых дидезоксинуклеозидтрифосфатов. Фрагменты разделяют по размеру с помощью капильрногоэлектрофареза. Когда фрагменты определённойдлиныпроходят через окно детектора, освещаемое лазерным лучом, дидезоксинуклеозидтрифосфаты начинают флуоресцировать. Длина волны флуоресценции зависит от того, какой именно дидезоксинуклеозидтрифосфат находится у них на конце, так что на выходе получается цветная картинка,которую можно трансформировать в нуклеотидную последовательность. Приемущество в том,что этот метод достаточно автоматизирован,могутсеквенировать до 1000.

7. Второе поколение методик

основные принципы

1.Исключено клонирование in vivo

2.полный отказ от электрофореза

3.только флуоресцентные метки

4.минитюаризация реакций

5.секвенируемые фрагменты короче,но их гораздо больше

6.максимальная автоматизация

7.возможность секвенировать геном человека за неделю

Пиросеквенирование

1.Конструированеи библиотек(ультразвуковая фрагментация анализируемой ДНК,пришивка адапторов и денатурация ДНК)

2.Эмульсионная ПЦР(получение эмульсии,содержащей в микрокаплях единичные фрагменты ДНК и полистирольные шарики с пришитым праймером,проведение ПЦР,отмывка микрошариков от реагентов и удаление несвязанных с шариками нитей ДНК)

3.Загрузка пикотитровальной планшетки(загрузка шариков в лунки проточной камеры,загрузка лунок микрокапсулами с иммобилизированными ферментами)

4.Секвенирующая реакция

Перспективы:

1.увеличение длины прочтения до уровня метода сэнгера

2.автоматизация эмульсионной ПЦР

Пиросеквенирование это метод секвенирования ДНК (определение последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК), основанный на принципе «секвенирование путем синтеза». При включении нуклеотида происходит детекция высвобождающихся пирофосфатов. "Секвенирование путем синтеза" заключается в том, что для секвенированияодноцепочечнойДНК ферментативно синтезируют комплементарную цепочку. Метод пиросеквенирования основан на детекции активности фермента ДНК-полимеразы с другим хемилюминесцентным ферментом. Метод позволяет секвенировать одну цепочку нуклеотидов ДНК путем синтеза комплементарной цепочки, при этом регистрируется присоединение каждого нуклеотида. Матрица ДНК иммобилизована, растворы нуклеотидов A, C, G и T добавляются и отмываются последовательно после реакции. Свет образуется в тот момент, когда раствор нуклеотидов соответствует первому неспаренному основанию матрицы. Последовательность растворов, которые дают хемилюминесцентный сигнал, позволяет определить последовательность матрицы.

Матрица одноцепочечнойДНКгибридизуется с праймером и инкубируется с ферментами ДНК-полимеразой, АТФ-сульфурилазой, люциферазой и апиразой, а также с субстратами аденозин-5´-фосфосульфатами (APS) и люциферином.

1.Добавление одного из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP)(в случае dATP добавляют dATPαS, который не является субстратом для люциферазы) инициирует следующий этап. ДНК-полимераза включает правильный комплементарный дезокси-нуклеотид в цепочку. При этом стехиометрически высвобождается пирофосфат (PPi).

2. Фермент АТФ-сульфурилаза количественно превращает PPi в аденозинтрифосфат (АТФ) в присутствии аденозин-5´-фосфосульфата. АТФ выступает "топливом" для фермента люциферазы, которая превращает люциферин в оксилюциферин, при этом высвобождается видимый свет, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшегося АТФ, Свет образуется в реакции, катализируемой люциферазой, регистрируется камерой и далее анализируется специальной компьютерной программой.

3.Невключенные нуклеотиды и АТФ подвергаются деградации ферментом апиразой, и реакция начинается с новым нуклеотидом.

В настоящий момент, существуют некоторые ограничения в применения данного способа секвенирования. Лимитирующим фактором является длина последовательности нуклеотидов, которая составляет около 300-500 нуклеотидов, что короче, чем 800-1000 нуклеотидов, достижимые методом обрыва цепи (например, метод Сэнгера). Такие ограничения могут затруднять секвенированиегеномов, в частности, богатых повторенными последовательностями нуклеотидов. К 2007 году, пиросеквенирование обычно использовали для повторного секвенирования или секвенирования геномов, для которых известна последовательность нуклеотидов родственного вида.

Достоинства: высокая скорость, не нуженэлектрофарез, автоматизированный;

Недостатки: нужен опыт работы и очень дорогое финиширование.

Длина читаемой последовательности примерно 600 н.п.;количетво одновременных реакций: 1.25 млн; продолжительность рабочего цикла6 чаов.

8.Секвенирование путем синтеза

Принцип:детекция флуоресценции присоединяемых ДНК-полимеразой нуклеотидов

длина читаемой последовательности:100 н.п.

количество одновременных реакций: 2 млрд.

Реакции происходят в проточной камере с восмью каналами

Создание кластера матриц(фрагменты ДНК иммобилизируются на поверхности проточной камеры,затем амплифицируются про помощи ПЦР)результат до млрд кластеров с идентичными молекулами ДНК в каждом

Регистрация включенного нуклеотида(пошаговая процедура.один шаг включает:присоединение нуклеотида с флуоресцентным терминатором,считывание флуоресценции,отсоединение терминатора вместе с флуоресцентной меткой)

Считывание последовательности ДНК(после присоединения каждого нуклеотида прибор сохраняет изображение(с очень высоким разрешением)флуоресценции всмех кластеров проточной камеры.анализ изолбражений(очень ресурсоемкий)позволяет определить последоваптекльность присоединенных при копировании каждой матрицы нуклеотидов)

ДНК-полимеразы-процессивные ферменты,рассчитанные на включение большого числа нуклеотидов без отсоединения от матрицы.Постоячнные остановки и перезапуск полимеразной реакции приводят к ошибкам и существенно ограничивавющей длину последовательности ДНК,которую можно считать при помощи этого метода.

Копии ДНК разрезаются в случайных местах на большое число небольших участков.

(2) К каждому участку с двух сторон добавляют специальные адаптеры – заранее известные небольшие последовательности нуклеотидов.

(3) Затем полученная смесь помещается на специально подготовленную подложку, из которой в виде решётки «растут» участки ДНК, комплементарные адаптерам. Таким образом, они способны «привязать» снабжённые адаптерами участки ДНК к этим местам. Кроме того, адаптеры также содержат праймеры, участки, к которым может присоединиться ДНК-полимераза, которая осуществляет репликацию ДНК.

(4) На шаге 3 разные участки ДНК случайным образом «присасываются» к разным местам в решётке. Теперь мы многократно клонируем каждый участок вокруг своего места, получая тем самым целые «кластеры». Этот процесс известен как bridgeamplification, потому что ДНК привязывается к подложке сразу двумя концами; о том, что это означает для биоинформатики, мы поговорим в следующем разделе.

(5) Участки ДНК денатурируют (разрушают водородные связи) – в результате из узлов решётки на подложке «растут» разные участки ДНК, состоящие из одной нити.

(6) Подложка помещается в раствор, содержащий ДНК-полимеразу и специально помеченные нуклеотиды, которые сразу же заканчивают процесс репликации (если помните, в сэнгеровскомсеквенировании такие тоже применялись). Они присоединяются к ДНК, по одному к каждому участку. Соответственно, к каждому участку присоединяется та «буква», с комплементарной к которой он начинается.

(7) Затем «лишние» нуклеотиды смывают, а метки оставшихся считывают; в технологии Illumina это флуоресцентные метки, которые можно заставить светиться разным цветом и сфотографировать. Именно на этом шаге мы и узнаём, с какой буквы начинается каждый «кластер участков» ДНК.

(8) После этого с уже связанных нуклеотидов химически «срезается» радикал, который мешал дальнейшей надстройке молекулы ДНК. Теперь можно вернуться на шаг 6 и повторить процесс, читая на втором цикле вторые буквы в каждой последовательности, и так далее.

В результате на каждом цикле мы прочитываем одновременно очень большое число нуклеотидов из разных последовательностей. Но за это приходится платить тем, что участки ДНК, которые мы можем прочесть, оказываются гораздо короче, чем в случае секвенирования по Сэнгеру – ридыIllumina обычно получаются длиной около 100 нуклеотидов.

10.

Основные характеристики:

1.сиквенс одиночных молекул ДНК

2.не используется ни одно ни другое клонирование

3.максимальная миниатбриизация

4.повышена скорость реакций

5.увеличена длина читаемой последовательности

6.удешевление

7.разработка новых методов

Основные характеристики методик:

Сиквенс одиночных молекул ДНК, максимальная миниатюризация, повышена скорость реакции, существенное удешевление. Наиболее сложная проблема методик 3-го поколения-детекция очень слабого сигнала одиночного флуорофора на фоне флуоресценции многих меченных нуклеотидов.

Технологии секвенирования третьего поколения позволят секвенировать геном человека в течение трех минут и всего за 5000 долларов.Система позволяет работать с геномами растений, людей, бактерий, дрожжей, животных, вирусов как на уровне ДНК, так и РНК. Система SOLID™: - содержит интегрированную компьютерную систему с возможностью анализа данных в режиме реального времени и возможностью контроля процесса анализа по сети; - включает широкий спектр программного обеспечения; - обладает высочайшей точностью; - поддерживает мультиплексный анализ при помощи "штрих-кодирования" (анализ до 256 образцов за один прогон);

Принцип:Чтобы максимально ускорить процесс,секвенируют одновременно тысячи и даже миллионы разных фрагментов матрицы. Для этого на одной подложке и проводят реакцию удлинения цепи с регистрацией флуоресценции. Альтернативный подход состоит в иммобилизации бусинок с миллионами копий матрицы и одновременном их секвенировании методом лигирования.

Секвенировани с помощью нанопор. Отрицательно заряженная одноцепочечная ДНК проходит через нанометровую пору в мембране, наружная поверхность которой несёт отрицательный заряд, а внутренняя– положительный. Как только очередной нуклеотид перекрывает внутреннее отверстие в поре, электропроводность мембраны изменяется. Нуклеотиды разного типа, из которых состоит цепочка ДНК, немного различаются по размерам и поэтому закрывают пору в большей или меньшей степени и на разное время. Соответственно этому, изменяется и электропроводность. Если удастся существенно повысить разрешающую способность метода, то каждый скачок электопроводности будет отвечать прохождению через пору нуклеотида, и с диаграммы, получаемой на выходе, можно будет считывать нуклеотидные последовательности.