3. Избирательное расщепление химических связей.
А.Разрыв дисульфидных мостиков в молекулах белков.
Необходим для обеспечения последующего этапа фрагментирования полипептидной цепи и для превращения всех остатков цистеина в остатки цистеиновой кислоты, не разрушающейся при дальнейшем анализе.
1) окисление надмуравьиной кислотой:
R1-CH2-S-S-CH2-R2 + H-CO-O-OH → R1-CH2-SO3Н + R2-CH2-SO3Н
Недостаток метода в том, что окисляются также остатки триптофана.
2) расщепление в присутствии сульфита:
R1-CH2-S-S-CH2-R2 + H2SO3 → R1-CH2-S-SO3H + R2-CH2-SH
3) восстановление дитиотреитолом или дитиоэритритолом:
После того как дисульфидные мостики разорваны, необходимо предотвратить их воссоединение, для чего надо перевести образующиеся тиоловые группы в устойчивые производные. Обычно для этой цели используют иодацетат или иодацетамид, образуются R-CH2-S-CH2-COOH или R-CH2-S-CH2-CONH2. Еще лучшим реагентом является акрилонитрил:
R-CH2-SH + CH2=CH-CN → R-CH2-S-CH2-CH2-CN
Б. Реагенты, избирательно расщепляющие пептидные цепи.
Одним из самых ценных реагентов при работе с белками является фенилизотиоцианат, впервые примененный Эдманом. Это соединение раегирует с N-концевой аминогруппой пептидов, образующийся продукт циклизуется и в кислой среде связь разрывается. Образуется фенилгидантоин, который можно идентифицировать. Проделав ту же операцию с укороченной пептидной цепью, можно определить следующий аминокислотный остаток.
На основе фенилизотиоцианатного метода Эдмана работают специальные приборы – секвенаторы, в которых все эти операции осуществляются автоматически. Метод Эдмана сводится к обработке фенилизотиоцианатом белка или пептида, присоединенного через С-концевую аминокислоту к инертному носителю (полистиролу или пористому стеклу) в колонке секвенатора. После промывки колонки метанолом и дихлорэтаном образовавшийся фенилтиокарбамилпептид подвергается воздействию безводной трифторуксусной кислоты, в результате чего высвобождается анилинотиазолинон и в его составе N-концевая аминокислота, а укороченный на один остаток пептид остается связанным с носителем. Анилинотиазолинон поступает в коллектор фракций и далее, после превращения в водной среде в фенилтиогидантоин – на хроматографическое определение отщепившейся N-концевой аминокислоты. После промывки растворителями, секвенатор готов к следующему циклу работы в автоматическом режиме.
Аминокислотную последовательность можно определять масс-спектрометрией, хотя этот метод сложен и применяется пока лишь к коротким 10-членным пептидам. Метод состоит в фрагментации аминокислотного типа эфиров ацилпептидов воздействием электронного удара с последующим разделением в масс-спектрометре полученных положительно заряженных фрагментов.
Существует множество других реагентов, расщепляющих пептидные связи внутри цепи в специфических местах. Особенно ценен бромциан, разрывающий цепь вслед за остатками метионина. Сера метионина замещает ион брома. Пространственная конфигурация образующегося сульфониевого соединения благоприятствует разрыву С-S-связи, протекающему с участием соседней пептидной группы. Гидролиз связи C=N в полученном продукте обусловливает разрыв пептидной цепи.
пептидилгомосеринлактон
Обработка гидроксиламином при высоких значениях рН часто приводит к избирательному разрыву связей Asp-Gly.