Обладнання

Для проведення хроматографічних досліджень необхідно мати хроматографічну камеру, розчинник або систему розчинників для хроматографування, фільтрувальний папір, насичений нерухомою фазою, або готові для тонкошарової хроматографії пластинки, розчини досліджуваних речовин.

Методика проведення хроматографічних визначень

Проведення висхідної паперової або тонкошарової хроматографії складається з таких операцій.

1. Підготовка хроматографічної камери

У хроматографічну камеру, що являє собою скляну посудину з притертою кришкою, вносять систему розчинників для хрома­тографування (рухома фаза), ретельно закривають камеру і зали­шають не менше ніж на 2 год для насичення.

2. Підготовка хроматографічного паперу і пластин

Хроматографічний папір, нарізаний у відповідності з формою і розміром камери, просочують нерухомою фазою (наприклад, буферним розчином), висушують. Пластинку «Silufol» розрізають на смуги певної ширини у відповідності з розмірами камери.

3.Нанесення розчинів речовин, що досліджуються

На висушеному папері або пластинці «Silufol» на відстані 1 – 2 см від краю відмічають олівцем лінію «старт», а через 10 см лінію «фініш». На лінії «старт» точками позначають місця нанесення проб так, щоб між ними була відстань 2,5 – 3 см, а від краю смуги 1,5 – 2 см. Досліджувані розчини наносять мікропіпеткою або капіляром. Після вбирання розчини наносять ще раз і дають ввібратися. Діаметр плями повинен бути не більш 0,5 см. Хроматографічний папір або пластинку поміщають у камеру для хроматографування.

4. Проявлення хроматограм і обчислен­ня хроматографічних констант

Хроматографування закінчують, коли розчинник досягає лінії «фініш». Папір або пластинку висушують. Проявляють хроматограму в УФ-променях, парами дийоду або оприскують розчином відповідного проявника.

Знаходять верхню кромку плями і ви­значають величину R_{f -} як відношення від­стані від стартової лінії до верхньої кромки плями і відстані від стартової лінії до лінії фронту розчинника:

R_f = Lx / Lp,

де Lx , Lp - відстань, яку пройшла речовина і розчинник відпо­відно.

Більш точною оцінкою хроматографічної рухомості є величи­на R_{f s}, яка являє собою відношення величини R_f одної речовини до величини R_f іншої речовини, прийнятої за стандарт.

Методами паперової і тонкошарової хроматографії в сполу­ченні з іншими фізико-хімічними методами можна проводити кількісні визначення речовин.

Хроматографування виконують способом, який описаний вище, проявляють пляму і кількісно елююють її з паперу відповідним розчинником. В одержаному елюаті або в сухому залишку після відгонки розчинника кількість досліджуваної речовини визнача­ють способом, який придатний для вимірювання малих концент­рацій (спектрофотометрія, фотоколориметрія). Для компенсації впливу домішок паралельно проводять контрольний дослід.

Кількісне визначення компонентів проби проводять також з вимірювання площини зон, одержаних на хроматограмі.

При хроматографуванні речовина розподіляється на хромато­грамі на площі, пропорційній її масі. Щоб уникнути помилок, у цьому методі використовують серію стандартних розчинів з різ­ним вмістом стандарту. Проводять хроматографування досліджу­ваної речовини та стандартів, вимірюють планіметром площі плям, будують калібрувальний графік залежності площі зон від маси стан­дарту і за графіком визначають масу компонента в розчині проби. Із-за достатньо великої помилки (±10 %) метод використовують для орієнтовних аналізів.

Лабораторна робота № 11

ПРИКЛАДИ ХРОМАТОГРАФІЧНИХ ВИЗНАЧЕНЬ

Дослід № 1

Розділення рослинних пігментів методом тонкошарової хроматографії

Мета роботи: оволодіти методикої розділення рослинних пігментів методом тонкошарової хроматографії.

Пігменти мають надзвичайно велике екологічне значення в житті рослин. За участю хлорофілу у клітинах рослин відбувається фотосинтез. Різні пігменти допомагають рослині пристосуватися до умов існування: саме тому гірська рослина едельвейс має майже біле листя, що відбиває надлишок сонячного випромінювання. За кольором листя рослин можна оцінити стан довкілля, використовуючи рослини як біоіндикатори, зокрема листя липи жовтіє від надлишку солі в грунті.

РЕАКТИВИ

Етанол;

подрібнене листя рослин, сік листя чи коренеплодів;

беззольний фільтр «синя стричка».

МЕТОДИКА ВИКОНАННЯ РОБОТИ

У спиртову витяжку (екстрат) листя, сіка листя чи коренеплодів у пробірці узанурюють смужку фільтрувального паперу завширшки 1 см і завдовжки 20 см.

Оскільки целюлоза краще сорбує хлорофіл, ніж каротин і ксантофіл, то відбувається розподіл пігментів у процесі підняття рідини: внизу з’являються зелені плями хлорофілу, вище – жовті плями каротину й ксантофілу.

Наносять краплю спиртового екстракту на круглий фільтр. Внаслідок різної сорбції пігментів утвориться кругова хроматографа – в центрі зелене коло, зовні – жовте.