6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_Котловский_Ю_В_ред_

- 11 -

Исследование гормонов методом иммунодиагностики на анализаторе Elecsus 2010 Roche Hitachi.

2. Полимеразно - цепная реакция (ПЦР) - анализ является самым современным, быстрым и точным методом диагностики на сегодняшний день. В 1993 году американский ученый Кэрри Мюллис за открытие метода ПЦР (ДНК метод) был удостоен Нобелевской премии. ПЦР диагностика используется сейчас всеми передовыми клиниками на Западе и в России.

В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определенного участка ДНК. В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. Большая точность метода достигается за счет высокой специфичности ПЦР -диагностики, так как в исследуемом материале выявляется уникальный фрагмент ДНК или РНК, характерный только для данного возбудителя, что прямо говорит о его присутствии в организме.

ПЦР - диагностика состоит из 3 основных процедур: подготовки исследуемой пробы материала, которая сводится к выделению ДНК или РНК, собственно полимеразной цепной реакции и детекции продукта ПЦР.

При этом чужеродный генетический материал многократно копируется в пробирке при помощи ДНК-полимеразы, а затем миллионные количества копий специфических фрагментов ДНК регистрируются визуально.

Это позволяет при ПЦР - диагностике обнаруживать даже единичные клетки бактерий или вирусов. Или в такой сложной ситуации, когда нужно обнаружить возбудителей с высокой антигенной изменчивостью или паразитирующих внутри клетки - их очень трудно обнаружить другими методами.

ПЦР – диагностика гепатитов на автоматизированной станции для выделения нуклеиновых кислот Easy MAG.

ПЦР - диагностика универсальна и тем, что позволяет обнаружить чужеродное ДНК в самых различных биологических тканях - слизи, моче, крови, мокроте, соскобе

- 12 -

эпителиальных клеток. И будут определены все возбудители, ДНК которых присутствовали в исследуемом материале. ПЦР – диагностика гепатитов проводится на автоматизированной станции для выделения нуклеиновых кислот Easy MAG.

3.Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР real-time)

PCR real-time - это современная молекулярно-генетическая технология, использующаяся для обнаружения ДНК возбудителей заболеваний.

PCR real-time - это полимеразная цепная реакция с гибридизационно - флуоресцентной детекцией в ходе реакции и компьютерной обработкой результата.

позволяет определить крайне низкие концентрации микроорганизмов с высокой специфичностью.

ПЦР в реальном времени это -

получение результата посредством компьютерной обработки данных о ходе реакции в цифровом и графическом формате

исключение субъективности в оценке результата врачом-лаборантом. Достоверность результата ПЦР анализа в реальном времени обеспечивается:

исключением возможности контаминации на этапе детекции (фиксирования результата)

использованием стандартных образцов, обеспечивающих контроль на всех этапах анализа.

ВЦНИЛ ПЦР- real-time используется для диагностики:

трихомониаза (Trichomonas vaginalis)

гонореи (Neisseria gonorrhoeae)

бактериального вагиноза (Gardnerella vaginalis)

кандидоза (Candida albicans)

хламидиоза (Chlamidia Trachomatis)

уреаплазмоза (Ureaplasma species)

микоплазмоза (Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium)

туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis)

Вируса папилломы человека (ВПЧ) на приборе Rotor-Gene.

Выполнение метода Real Time на приборе Rotor-Gene.

4. Метод NASBA Real Time новейший метод в клинической лабораторной практике, основанный на высокоэффективной технологии амплификации - NASBA Real Time, запатентованный компанией Biomerieux (Франция). Тест-системы предназначены для диагностики инфекций, передающихся половым путем.

- 13 -

NASBA - это метод изотермической амплификации нуклеиновых кислот, который обладает уникальной способностью избирательно амплифицировать специфическую последовательность РНК в присутствии идентичной последовательности ДНК, т.е. в отличие от обычной ПЦР, мишенью для NASBA служат молекулы РНК рибосом микроорганизмов, что дает целый ряд преимуществ перед ПЦР.

Диагностическая значимость различных методов неравнозначна. Уже давно является абсолютно очевидным, что рутинная окраска мазков по Романовскому-Гимзе и т. д. не позволяет диагностировать хламидиоз в 75-80% случаев. Трудоемкость и дороговизна культивирования хламидий сделала возможным использование культурального метода лишь в научных целях в качестве модели хламидийной инфекции. Таким образом, культуральный и микроскопический методы диагностики не нашли повсеместного клинического применения. Прямая иммунофлюоресценция, основанная на выявлении МОМР и иммуноферментный анализ, позволяющий выявить наличие ЛПС в пробе, на сегодняшний день являются наиболее распространенными в клинической практике.

5.Метод прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) с использованием моноклональных антител к основному белку наружной мембраны стал доступен с середины 80-х годов. В странах Запада чаще других используются тест-системы Micro Irak (Syva, Bohring Diagnostics UK Ltd., Milton, Keynes, UK). Несмотря на простоту и удобство в исполнении, мнения об их чувствительности и специфичности расходятся. По данным литературы, чувствительность ПИФ составляет около70-100 % для мужчин и 68 – 100 % для женщин, а специфичность соответственно 87 - 99% и 100%. Верхние пределы чувствительности и специфичности указывают на возможность обнаружения малого числа (<10) ЭТ и способность различать специфическое и неспецифическое, свечение «4+» - очень яркая зеленая флюоресценция; «3+» - яркая зеленая флюоресценция; «2+» - слабая зеленая флюоресценция; «1+» - теневая зеленая флюоресценция; «-» - отсутствие свечения.

Результат считается положительным, если в мазке регистрируется яркое зеленое свечение в виде точки (для ЭТ) или овала (для РТ) не менее, чем «3+», выделяющееся на фоне эпителиальных клеток, окрашенных в темно бордовый или ярко-оранжевый цвет. Результат считается отрицательным при отсутствии специфического свечения. Сомнительной считается реакция при обнаружении единичных телец хламидий с интенсивностью окраски «2+» или в отсутствие клеток эпителия в поле зрения. При повторном получении сомнительного результата проба считается отрицательной.

6.Цитологические методы: а) Исследование клеток и тканей биопсийного материала, гистологический метод. b) Выявление аномального кариотипа периферической крови и костного мозга – метод микроскопии. Исследование хромосомного аппарата ядра клетки с оценкой количества и структуры каждой индивидуальной хромосомы.

Кариотипирование - является обязательным исследованием при бесплодии, невынашивании, наличии соматических и генитальных пороков развития у обследуемого и среди кровных родственников, при наличии психических, нервных, обменных заболеваний, заболеваний опорно-двигательного аппарата. При планировании беременности у обоих супругов, с целью определения правильного генетического кода обследуемого, кариотип крови является элементарным генетическим паспортом человека. С него должно начинаться любое медицинское обследование.

- 14 -

Выполнение метода кариотипирования. Программа кариотест-5.

7. Бак посев и определение чувствительности к антибиотикам. Культуральный метод.

Выполнение культурального метода и определение чувствительности к антибиотикам.

Принцип метода – идентификации и титрования урогенитальных инфекций основан на специфических метаболических свойствах каждого микроорганизма. Метод диагностики бактериальных инфекций является одним из наиболее «старых» и широко применяемых. Эти методы являются «золотым стандартом». Чувствительность и специфичность бактериологической диагностики значительно превосходит микроскопирование и достигает при выполнении квалифицированным персоналом 80-90 и более процента. Преимуществом этой методологии является возможность обнаружения «живой» (жизнеспособной) бактериальной клетки, простейших, установления их чувствительности к лекарственным препаратам.

8. Проточная цитофлюориметрия – исследование иммунного статуса. Проводится на проточном цитофлуориметре Epics – XL Becrman Coulter (США). В основе метода лежит проведение фотометрических и флюоресцентных измерений отдельных клеток, пересекающих одна за другой вместе с потоком жидкости, лазерный луч монохроматического света.

- 15 -

Исследование иммунного статуса на цитофлуориметре «Еpics» (США)

9. Анализ мочи на Urisys 1100 - это рефлексионный фотометр, разработанный для считывания и оценки тест - полосок для анализа мочи Combuz 10 Test μ. Определяется относительная плотность (удельный вес), кислотность (ph), лейкоциты, нитриты, белок, глюкоза, кетоны, уробилиноген, билирубин, эритроциты.

Анализ мочи на общий белок проводится на фотометрическом анализаторе АОБМФ-01 «НПП-ТМ» Белур 600.

Выполнение анализа мочи на приборе Urisys 1100

10. Развернутый анализ крови исследуется на гематологическом анализаторе «Medonic» Швейцария. Особенности этого анализа:

Анализ выполняется на одном из самых надежных современных автоматических гематологических анализаторов «Medonic» (Швеция).

анализ включает в себя 18 параметров

для анализа требуется минимальное количество крови, что очень удобно при обследовании детей

плавное перемешивание крови на специальном миксере и использование одноразовых стерильных систем исключает все возможные ошибки, связанные с «человеческим фактором»

анализатор оснащен: строжайшей системой «двойного контроля» за дозированием крови, сверхточным устройством, корректирующим границы нормы с учетом возраста и пола пациента, корректирующим концентрацию гемоглобина при лейкозах, гарантирующим максимальную точность получаемых результатов не только при анализе нормальных, но и патологических образцов крови.

Кровь на развернутый анализ берется из вены, строго натощак.

- 16 -

Исследование развернутого анализа крови

на автоматическом гематологическом анализаторе «Medonic» Швейцария.

11.Исследование системы гемостаза на коагулографе «Start», диагностические наборы «Roshe Diagnostic», производство Швейцария. Проводится для своевременного выявления и предотвращения образования тромбов или склонности к кровоточивости.

12.Оценка состояния участков костей на приборе Sunlight Omnisens 7000, Израиль. Проводится в ультразвуковом режиме. Оценивается белковая и минеральная структура костной ткани. Ультразвуковой костный сонометр является точным и удобным неинвазивным ультразвуковым прибором, способным измерять состояние кости в различных участках скелета человека.

Оценка состояния участков костей на приборе Sunlight Omnisens 7000

13. Биохимический анализ крови на Cobas integra 400 Plus (Рош, Швейцария) выполняет широкий спектр биохимических исследований: субстраты, ферменты, электролиты, специфические белки, лекарственный мониторинг, наркотики.

- 17 -

Выполнение биохимического анализа крови на Cobas integra 400 Plus (Рош, Швейцария)

14. Определение метиловых эфиров жирных кислот в диагностике сердечнососудистых заболеваний (ИБС, стенокордия) на газовом хроматомассспектрометре

«Agilent technologies 5975C VLMSD» (США)

Работа на газовом хроматомассспектрометре «Agilent technologies 5975C VLMSD»

15.Синтез праймеров.

Синтез праймеров на ДНК-синтезаторе (DNA-synthesizer, Bioset)

- 18 -

Методы, основанные или включающие в себя этап амплификации нуклеиновых кислот, например такие как: PCR, NASBA-RT, PCR-RT, LCR, сиквенирование, клонирование, биочипы и др., на сегодняшний день, являются ведущими как в диагностике заболеваний, так и в научных исследованиях в сфере молекулярной биологии, медицины и генетики.

Ключевым звеном всех этих молекулярно-генетических методов является использование синтетических олигонуклеотидов (праймеров).

В лаборатории поставлена методика разработки и синтеза праймеров. Для разработки используется современное программное обеспечение. Синтез осуществляется на ДНК-синтезаторе (DNA-synthesizer, Bioset)/

Методика открывает широкую область применения в сфере диагностики и науки.

16. Молекулярно-генетическое установление биологического отцовства и идентификация личности.

Молекулярно-генетическая идентификация человека по биологическим жидкостям и костям на генетическом анализаторе «Applied biosystems».

17.Функциональные методы диагностики:

a)УЗИ всех органов.

УЗИ на аппарате Hitachi EUB-5500.

b)Эхокардиография (УЗИ сердца) с доплерографией – оценка кровотока, состояния камер сердца, клапанов, сократительной способности миокарда в норме и при патологии.

- 19 -

Эхокардиография на аппарате Hitachi EUB-5500.

c)Реоэнцефалография (РЭГ) – определение тонуса мозга, объема кровенаполнения, нарушение венозного оттока, влияние позвоночных артерий на кровоснабжение мозга.

Реоэнцефалография на реографе Мицар – Рео.

d)Кардиоинтервалография – определение состояния вегетативной нервной системы, выявление нарушений сердечного ритма в покое и после ортостатической нагрузки.

e)Компьютерная пульсовая диагностика – оценка функционального состояния организма, в том числе на уровне «до заболевания» (желудочно-кишечного тракта, дыхательной, сердечно-сосудистой, мочеполовой, иммунной, эндокринной систем)

f)Спирография – исследование бронхиальной (дыхательной) системы.

g)Кардиоритмография (КРГ) – определение состояния вегетативной нервной системы, выявление нарушений сердечного ритма в покое и после ортостатической нагрузки.

h)Рэовазография (РВГ) – определение состояния кровообращения сосудов верхних и нижних конечностей.

i)Холтеровское (суточное ЭКГ) мониторирование сердечного ритма – исследование сердечного ритма в покое и после нагрузки в течении суток, выявление ишемии миокарда.

-20 -

j)Суточное мониторирование артериального давления (СМАД) – наблюдение за показателями артериального давления в течение суток в различных режимах деятельности пациентов.

k)Электрокардиография (ЭКГ) – определение состояния сердечной деятельности в покое и с нагрузкой.

ИССЛЕДОВАНИЯ, ВЫПОЛНЯЕМЫЕ ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ЖЕЛУДОЧНО – КИШЕЧНОГО ТРАКТА, ИНФЕКЦИОННОЙ ЭТИОЛОГИИ

1. Комплексная диагностика гельминтозов методом ИФА (Описторхоз —

пероральный биогельминтоз, вызываемый трематодой семейства Opisthorhidae (Opisthorchis felineus и Opisthorchis viverrini). Заражение человека, кошек, собак, лисиц,

песцов и некоторых других плотоядных животных (окончательных хозяев данного паразита) происходит при употреблении в пищу инвазированной личинками описторхисов рыбы семейства карповых (сазан, карась, язь, елец, чебак, вобла, линь, лещ, и др.)- При попадании в желудочно-кишечный тракт личинки (называемые матацеркариями) эксцистируются в двенадцатиперстной кишке и мигрируют через желчный пузырь во внутрипеченочные желчные протоки.

Личинка описторхиса

У инвазированных лиц в 20—40% случаев описторхисы также обнаруживаются в протоках поджелудочной железы и желчном пузыре. В течение 3-4 недель с момента попадания в организм хозяина гельминты достигают половой зрелости и начинают откладывать яйца. Точное время жизни данного паразита в организме инвазированного человека не установлено, по предположению одних исследователей он живет 20-25 лет, другие считают, что в течении всей жизни возможны реинфекции. Каждый гельминт за это время может секретировать много миллионов яиц, размер яйца около 0,025 мм в диаметре. Взрослый описторхис имеет размеры 5-10 х 1-2 мм, основой для его питания служит детрит и эпителиальный секрет, а источником кислорода - кровь хозяина. Этот паразит не может завершить свой жизненный цикл в одном организме, ему необходим выход во внешнюю среду и дальнейшее развитие в другом хозяине. Поэтому описторхоз не контагиозен при непосредственном контакте с инвазированными людьми и животными.

Важным звеном цикла развития O.felineus является попадание выделенных с фекалиями больных животных и человека яиц гельминта в пресные водоемы, в которых имеются заглатывающие их переднежаберные моллюски рода Bithynia. В организме этих промежуточных хозяев из яиц появляются личинки гельминта мирацидии (первая личиночная стадия), которые за 2 месяца проходят несколько стадий развития, включающих размножение, и превращаются в церкарии. Церкарии, имеющие в качестве органа передвижения хвост, выходят в воду и активно внедряются в тело пресноводных карповых рыб. В мышцах этого дополнительного хозяина церкарии превращаются в следующие личинки метацеркарии, покрытые защитной оболочкой.

Инвазия человека описторхисами приводит к различным нарушениям здоровья человека — развитию холангита, холецестита, гепатита, панкреатита, цирроза печени, аллергического дерматита, камней в желчевыводящих протоках и протоках