- •Предисловие
- •Введение в биохимический практикум
- •I. Материал и его подготовка для биохимических исследований
- •2. Основные методы разделения и выделения веществ при биохимиеских иследованиях
- •3. Основные приборы, используемые в практикуме
- •Фотометрические приборы
- •Флуориметрические приборы
- •Центрифуги
- •Приборы для электрофореза
- •4. Применение единиц си для выражения результатов клинико-биохимических исследований Общие положения
- •Некоторые рекомендации по применению единиц си в клинико-биохимических исследованиях
- •1.Химическая природа простых белков
- •Работа 1. Качественные (цветные) реакции на функциональные группы белков и аминокислот
- •Работа 2. Качественный анализ некоторых белковых препаратов
- •Работа 3. Хроматографический метод разделения аминокислот
- •2. Исследование физико-химических свойств белков
- •Работа 4. Диализ белков
- •Работа 5. Определение изоэлектрической точки белка
- •Приготовление буферных систем для определения иэт казеина
- •Работа 6. Исследование денатурации белков
- •Работа 7. Исследование высаливания белков
- •3. Количественный анализ белков
- •Работа 8. Количественное определение белка в сыворотке крови
- •4. Состав и свойства сложных белков
- •Работа 9. Химическая природа гемпротеидов
- •Работа 10. Выявление углеводного компонента гликопротеидов
- •Работа 11. Качественные реакции на фосфопротеиды
- •Работа 12. Количественное определение содержания сиаловых кислот в сыворотке крови методом Гесса
- •Работа 13. Химическая природа нуклеопротеидов
- •Нуклеиновые кислоты
- •1. Исследование химической природы нуклеиновых кислот
- •Работа 14. Качественные реакции на компоненты нуклеиновых кислот
- •Количественные методы определения нуклеиновых кислот
- •Работа 15. Спектрофотометрический метод количественного определения нуклеиновых кислот по а.С.Спирину
- •Работа 16. Фотоколориметрические методы количественного определения нуклеиновых кислот
- •Работа 17. Исследование фосфолипидов
- •Работа 18. Качественные реакции на стероиды
- •Ферменты
- •Сравнительное действие ферментов и небиологических катализаторов
- •Работа 19. Сравнение действия α-амилазы слюны и соляной кислоты на реакцию гидролиза крахмала
- •2. Выявление ферментов, относящихся к разным классам
- •Работа 20. Обнаружение оксидоредуктаз в биологическом материале
- •Работа 21. Обнаружение холинэстеразы
- •В сыворотке крови экспресс-методом Херцфельда и Штумпфа
- •Работа 22. Определение активности фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы в сыворотке крови по методу в.И.Товарницкого и е.Н.Волуйской
- •Построение калибровочного графика
- •Работа 23. Определение глюкозофосфат-изомеразы
- •В сыворотке крови
- •3. Изучение кинетических свойств ферментов
- •Работа 24. Кинетика ферментативных реакций на примере α-амилазы слюны
- •4. Специфичность действия ферментов
- •Работа 25. Демонстрация абсолютной субстратной специфичности
- •5. Модификаторы активности ферментов
- •Работа 27. Активаторы и ингибиторы α-амилазы слюны
- •Мышечной ткани
- •Работа 29. Неконкурентное ингибирование каталазы крови
- •6. Количественное определение активности ферментов
- •Работа 30. Количественное исследование активности препарата лактатдегидрогеназы по Корнбергу
- •Работа 31. Фотоколориметрический метод исследования активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови по Севелу и Товареку
- •Работа 32. Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови по Боданскому
- •7. Исследование изоферментов
- •Работа 33. Разделение изоферментов лактатдегидрогеназы сыворотки крови методом электрофореза в полиакриламидном геле по Дитцу и Лубрано
- •Работа 34. Определение активности γ-глутамилтрансферазы в сыворотке крови
- •Биохимия пищеварения
- •Работа 35. Исследование кислотных компонентов желудочного сока
- •Работа 36. Определение кислотности желудочного сока диагностическим набором «Ацидотест»
- •Работа 37. Гидролиз белка ферментами пищеварительного тракта
- •Работа 38. Изучение динамики гидролиза триацилглицеринов под действием панкреатической липазы
- •Энергетический обмен (биоэнергетика)
- •1. Исследование процессов биологического окисления в животных тканях Работа 39. Обнаружение цитохромоксидазы в мышечной ткани
- •Работа 40. Демонстрация процесса окислительного фосфорилирования и действия на него разобщителей
- •Работа 41. Выявление гликолиза в мышечной ткани
- •Работа 42. Анализ адениннуклеотидов методом ионообменной тонкослойной хроматографии
- •Работа 43. Определение активности креатинфосфокиназы в сыворотке крови по Эннору и Розенбергу
- •Анализ пигментов и окислительных процессов фотосинтезирующих организмов
- •Работа 44. Качественные реакции на пигменты растений
- •Работа 45. Определение активности пероксидазы в растительном материале по методу а.Н.Бояркина
- •Обмен углеводов
- •Работа 46. Определение содержания глюкозы в крови
- •Работа 47. Количественное определение содержания глюкозы в крови глюкозооксидазным методом
- •Работа 48. Определение содержания молочной кислоты в крови по Баркеру и Саммерсону
- •Работа 49. Определение содержания пировиноградной кислоты в крови по Фридеману и Хаугену
- •Обмен липидов
- •Работа 50. Определение содержания суммарных липидов в сыворотке крови по реакции с сульфофосфованилиновым реактивом
- •Работа 51. Определение содержания β- и пре- β-липопротеидов сыворотки крови турбидиметрическим методом по Бурштейну и Самай
- •Работа 52. Определение содержания холестерина в сыворотке крови по методу Илька
- •Работа 53. Определение содержания общих фосфолипидов в сыворотке крови
- •Работа 54. Разделение липидов сыворотки крови методом тонкослойной хроматографии
- •Обмен белков и аминокислот
- •Работа 55. Определение содержания белковых фракций сыворотки крови турбидиметрическим методом
- •Работа 56. Определение активности катепсинов в сыворотке крови по а.А.Покровскому, а.И.Арчакову и о.Н.Любимцевой
- •Катепсины
- •Работа 57. Определение активности аспартат- и аланин- аминотрансферазы в сыворотке крови по Райтману и Френкелю
- •Работа 58. Определение активности гистидазы в сыворотке крови по Табору и Мелеру в модификации в.А.Буробина
- •Работа 59. Определение содержания свободного гидроксипролина в моче по Нейману и Логану в модификации п.Н.Шараева
- •Обмен азотсодержащих небелковых веществ
- •1. Исследование общих продуктов азотистого обмена
- •Работа 60. Количественное определение остаточного азота в крови фотоколориметрическим методом
- •Работа 61. Количественное определение мочевины в сыворотке крови и моче
- •Работа 62. Количественное определение креатина и креатинина по методу Брауна
- •2. Изучение обмена нуклеиновых кислот и нуклеотидов
- •Работа 63. Определение активности кислой дезоксирибонуклеазы (днКазы) в сыворотке крови по а.А.Покровскому, а.И.Арчакову и о.Н.Любимцевой
- •Работа 64. Определение содержания мочевой кислоты в сыворотке крови по методу Мюллера и Зейферта
- •3. Исследование порфиринового (пигментного) обмена
- •Работа 65. Определение билирубина и его фракций в сыворотке крови по Йендрашику, Клеггорну и Грофу
- •Молекулярная патология
- •1. Экспресс-диагностика патологии аминокислотного обмена Работа 66. Выявление гипераминоацидурии
- •Работа 67. Экспресс-методы диагностики фенилкетонурии
- •Работа 68. Диагностика тирозиноза пробой Миллона на тирозин
- •Работа 69. Выявление алкаптонурии пробой на гомогентизиновую кислоту
- •Работа 70. Выявление цистинурии иод-азидной пробой на цистин и гомоцистин в моче
- •2. Экспресс-диагностика патологий углеводного обмена Работа 71. Выявление пентозурии пробой Биаля
- •Работа 72. Выявление фруктозурии пробой Селиванова
- •Работа 73. Выявление мукополисахаридозов пробой с толуидиновым синим на мукополисахариды
- •Работа 74. Определение содержания порфобилиногена в моче
- •Работа 75. Количественное определение содержания дельта-аминолевулиновой кислоты в моче
- •Работа 76. Количественное определение содержания копропорфирина в моче по методу Соулсби в модификации Римингтона
- •Регуляторы обмена веществ
- •1. Исследование витаминов Работа 77. Качественные реакции на витамины
- •Работа 78. Определение содержания тиамина и рибофлавина флуориметрическим методом в поливитаминных препаратах
- •Работа 79. Количественное определение аскорбиновой кислоты в лекарственных растениях
- •2. Исследования гормонов, медиаторов и их метаболитов
- •Работа 80. Качественные реакции на белково-пептидные гормоны.
- •Работа 81. Качественные реакции на гормоны – производные аминокислот
- •Работа 82. Качественные реакции на стероидные гормоны и их метаболиты
- •Работа 83. Регуляция инсулином и адреналином уровня глюкозы в крови животных
- •Работа 84. Количественное определение гистамина в крови с диазотированным n-нитроанилином по н.В.Климкиной и с.И.Плитману
- •Исследование биологических жидкостей
- •1. Биохимические исследования крови Работа 85. Определение содержания гемоглобина в крови по его светопоглощению
- •Работа 86. Определение содержания фетального гемоглобина в эритроцитах крови человека
- •Работа 87. Определение содержания гликозилированного гемоглобина в эритроцитах крови фотоколориметрическим методом
- •Работа 88. Определение концентрации гаптоглобинов в сыворотке крови фотоколориметрическим методом
- •Работа 89. Проба Вельтмана в модификации Тейфеля на коллоидную устойчивость белков сыворотки крови
- •Работа 90. Определение активности α-амилазы в сыворотке крови амилокластическим методом
- •Работа 91. Определение содержания кальция в сыворотке крови мурексидным методом
- •Работа 92. Тимоловая проба по Хуэрго и Поппер
- •Работа 93. Сулемово-осадочная реакция
- •Работа 94. Количественное определение содержания железа в сыворотке крови
- •2. Биохимическое исследование мочи
- •Работа 95. Исследование физико-химических свойств мочи
- •Работа 96. Определение кетоновых тел и глюкозы в моче
- •Работа 97. Определение белка в моче по методу Бранденберга-Робертса-Стольникова
- •Работа 98. Качественное определение индикана в моче
- •Работа 99. Обнаружение некоторых пигментов в моче.
- •Метаболизм ксенобиотиков
- •Исследование процессов окисления и конъюгации ксенобиотиков Работа 100. Выявление дыхательной активности микросом
- •Работа 101. Исследование окислительного n-деметилирования в микросомах печени по Нашу
- •Работа 102. Определение гидроксилазной активности микросом печени по Като и Жилете
- •Работа 103. Метод оценки активности монооксигеназ эндоплазматической сети клеток печени по выделению метаболитов амидопирина с мочой по т.А.Попову и о.Д.Леоненко
- •Работа 104. Определение активности алкогольдегидрогеназы в сыворотке крови по Шкурски и др. С дополнениями и.В.Бокия, м.С.Усатенко и в.Ф.Трюфанова
- •Работа 105. Определение ацетилирующей способности организма по выделению с мочой свободной и ацетилированной форм сульфаниламидов по а.М.Тимофеевой в модификации г.А.Пономарева
- •Работа 106. Выявление ацетилирования (инактивации) гидразида изоникотиновой кислоты (гинк) в организме
- •Исследование пероксидного окисления липидов биологических мемебран
- •Работа 107. Определение чувствительности эритроцитов к пероксидному гемолизу
- •Работа 108. Определение скорости пероксидного окисления липидов в биомембранах
- •Приложение
- •2.Биохимические показатели плазмы крови
- •1.Общие клинические нормы
- •2. Специальное исследование мочи
- •Желудочный сок
- •2. Фосфатный буфер (0,1 м, рН 5,8-8,0)
- •3. Трис-буфер (0,1 м, рН 7,1-9,2)
- •4. Ацетатный буфер (0,2 м, рН 3,6-5,8)
- •5. Глициновый буфер (0,05 м, рН 8,6-10,6)
- •3. Приготовление некоторых реактивов
- •Оглавление
Работа 8. Количественное определение белка в сыворотке крови
Реактивы. Биуретовый реактив*; хлорид натрия, 0,9%-ный раствор.
Оборудование. Микропипетки и пипетки вместимостью 1 и 5 мл; штатив с пробирками; стеклянные палочки; фотоэлектроколориметр (ФЭК); спектрофотометр (СФ).
Материалы. Сыворотка крови; альбумин, 10%-ный раствор.
а. Биуретовый метод определения содержания белка в сыворотке крови. Метод основан на способности пептидных связей белков и полипептидов образовывать с ионами Cu2+ в щелочной среде комплексное соединение фиолетового цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию белка в среде.
Ход определения. Для определения содержания белка в сыворотке крови или в других объектах, содержащих белок, необходимо построить калибровочный график. Для этого применяют стандартный белок – кристаллический альбумин сыворотки крови.
Схема разведения альбумина для построения калибровочного графика приведена в таблице:
№ пробирки |
Стандартный 10%-ный раствор альбумина, мл |
0,9%-ный раствор хлорида натрия, мл |
Концентрация белка, г/л |
Экстинкция |
1 |
0,4 |
0,6 |
40 |
|
2 |
0,6 |
0,4 |
60 |
|
3 |
0,8 |
0,2 |
80 |
|
4 |
1,0 |
- |
100 |
|
Из каждой пробирки с разведенным стандартным раствором альбумина берут по 0,1 мл раствора и добавляют по 5 мл биуретового реактива. Содержимое смешивают встряхиванием.
Через 30 мин измеряют экстинкцию каждой пробы на ФЭКе против контрольного раствора (0,1 мл 0,9%-ного раствора NaCl + 5,0 мл биуретового реактива) в кювете толщиной 1 см, длина волны 540-560 нм (светофильтр зеленый).
По полученным данным строят калибровочную кривую, откладывая по оси ординат значения экстинкции, по оси абсцисс – концентрацию белка.
Берут 2 пробирки – в одну наливают 0,1 мл исследуемой сыворотки, в другую (контрольную) – 0,1 мл раствора хлорида натрия. В обе пробирки добавляют по 5 мл биуретового реактива. Содержимое смешивают встряхиванием.
Через 30 мин измеряют экстинкцию исследуемого раствора на ФЭКе в кювете толщиной 1 см при длине волны 540-560 нм (зеленый светофильтр) против контрольного раствора.
Содержание белка в сыворотке крови находят по калибровочной кривой.
б. Спектрофотометрический метод определения содержания белка в сыворотке крови. Метод основан на светопоглощении при 280 нм ароматических радикалов тирозина, триптофана и в меньшей степени фенилаланина, содержащихся в белке. Однако при данной длине волны поглощают и нуклеиновые кислоты, хотя их максимум абсорбции приходится на 260 нм. Поэтому измерение экстинкции раствора проводят при 260 и 280 нм, чтобы сделать поправку на примесь нуклеиновых кислот и нуклеотидов. Метод неприменим к материалу, где содержание нуклеиновой кислоты превышает 20%.
Ход определения. В пробирку вносят 0,1 мл сыворотки крови и добавляют 9,9 мл раствора хлорида натрия. Содержимое перемешивают стеклянной палочкой.
Измеряют экстинкцию исследуемого раствора против контрольного раствора хлорида натрия на спектрофотометре в кювете толщиной 1 см при двух длинах волн – 260 и 280 нм.
Расчет можно проводить по формуле, эмпирически полученной Калькаром (поэтому можно не прибегать к калибровочному графику):
х = 1,45Е280 – 0,74Е260,
где х – концентрация белка в растворе, г/л.
Оформление работы. По калибровочной кривой рассчитать содержание белка. Сравнить результаты, полученные биуретовым методом и спектрофотометрическим. Сделать вывод о наличии отклонения концентрации белка в исследуемой сыворотке крови от нормы и о возможных его причинах.
Практическое значение работы. Сыворотка крови содержит смесь белков, различных по физиологическому значению, структуре и физико-химическим свойствам (более 100 различных белков плазмы крови). Нормальное содержание белка в сыворотке крови (нормопротеинемия) составляет 65-85 г/л. Определение общего белка в сыворотке крови находит широкое применение в практической медицине, так как по изменению его нормального содержания можно судить о различных нарушениях в организме. Повышенное содержание белка (гиперпротеинемия) относительно редко: при сгущении крови из-за потери жидкости (длительная рвота, усиленное потоотделение, холера, тяжелые ожоги и т.п.), при некоторых хронических воспалительных процессах вследствие образования антител (ревматизм, полиартрит). Пониженное содержание белка в крови (гипопротеинемия): при недостаточном поступлении белка с пищей (голодание, нарушение проходимости кишечного тракта), при нарушении образования белка в органах (при поражении печени химическими веществами, опухолями, микроорганизмами и т.д.), при потере белка организмом (кровотечения, повышенная проницаемость сосудов, заболевания почек, беременность и т.д.).
В фармацевтической практике количественные методы определения белка необходимы для контроля белковых лекарственных средств (вакцин, сывороток, γ-глобулина, белковых препаратов крови и т.д.).