- •Предисловие
- •Введение в биохимический практикум
- •I. Материал и его подготовка для биохимических исследований
- •2. Основные методы разделения и выделения веществ при биохимиеских иследованиях
- •3. Основные приборы, используемые в практикуме
- •Фотометрические приборы
- •Флуориметрические приборы
- •Центрифуги
- •Приборы для электрофореза
- •4. Применение единиц си для выражения результатов клинико-биохимических исследований Общие положения
- •Некоторые рекомендации по применению единиц си в клинико-биохимических исследованиях
- •1.Химическая природа простых белков
- •Работа 1. Качественные (цветные) реакции на функциональные группы белков и аминокислот
- •Работа 2. Качественный анализ некоторых белковых препаратов
- •Работа 3. Хроматографический метод разделения аминокислот
- •2. Исследование физико-химических свойств белков
- •Работа 4. Диализ белков
- •Работа 5. Определение изоэлектрической точки белка
- •Приготовление буферных систем для определения иэт казеина
- •Работа 6. Исследование денатурации белков
- •Работа 7. Исследование высаливания белков
- •3. Количественный анализ белков
- •Работа 8. Количественное определение белка в сыворотке крови
- •4. Состав и свойства сложных белков
- •Работа 9. Химическая природа гемпротеидов
- •Работа 10. Выявление углеводного компонента гликопротеидов
- •Работа 11. Качественные реакции на фосфопротеиды
- •Работа 12. Количественное определение содержания сиаловых кислот в сыворотке крови методом Гесса
- •Работа 13. Химическая природа нуклеопротеидов
- •Нуклеиновые кислоты
- •1. Исследование химической природы нуклеиновых кислот
- •Работа 14. Качественные реакции на компоненты нуклеиновых кислот
- •Количественные методы определения нуклеиновых кислот
- •Работа 15. Спектрофотометрический метод количественного определения нуклеиновых кислот по а.С.Спирину
- •Работа 16. Фотоколориметрические методы количественного определения нуклеиновых кислот
- •Работа 17. Исследование фосфолипидов
- •Работа 18. Качественные реакции на стероиды
- •Ферменты
- •Сравнительное действие ферментов и небиологических катализаторов
- •Работа 19. Сравнение действия α-амилазы слюны и соляной кислоты на реакцию гидролиза крахмала
- •2. Выявление ферментов, относящихся к разным классам
- •Работа 20. Обнаружение оксидоредуктаз в биологическом материале
- •Работа 21. Обнаружение холинэстеразы
- •В сыворотке крови экспресс-методом Херцфельда и Штумпфа
- •Работа 22. Определение активности фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы в сыворотке крови по методу в.И.Товарницкого и е.Н.Волуйской
- •Построение калибровочного графика
- •Работа 23. Определение глюкозофосфат-изомеразы
- •В сыворотке крови
- •3. Изучение кинетических свойств ферментов
- •Работа 24. Кинетика ферментативных реакций на примере α-амилазы слюны
- •4. Специфичность действия ферментов
- •Работа 25. Демонстрация абсолютной субстратной специфичности
- •5. Модификаторы активности ферментов
- •Работа 27. Активаторы и ингибиторы α-амилазы слюны
- •Мышечной ткани
- •Работа 29. Неконкурентное ингибирование каталазы крови
- •6. Количественное определение активности ферментов
- •Работа 30. Количественное исследование активности препарата лактатдегидрогеназы по Корнбергу
- •Работа 31. Фотоколориметрический метод исследования активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови по Севелу и Товареку
- •Работа 32. Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови по Боданскому
- •7. Исследование изоферментов
- •Работа 33. Разделение изоферментов лактатдегидрогеназы сыворотки крови методом электрофореза в полиакриламидном геле по Дитцу и Лубрано
- •Работа 34. Определение активности γ-глутамилтрансферазы в сыворотке крови
- •Биохимия пищеварения
- •Работа 35. Исследование кислотных компонентов желудочного сока
- •Работа 36. Определение кислотности желудочного сока диагностическим набором «Ацидотест»
- •Работа 37. Гидролиз белка ферментами пищеварительного тракта
- •Работа 38. Изучение динамики гидролиза триацилглицеринов под действием панкреатической липазы
- •Энергетический обмен (биоэнергетика)
- •1. Исследование процессов биологического окисления в животных тканях Работа 39. Обнаружение цитохромоксидазы в мышечной ткани
- •Работа 40. Демонстрация процесса окислительного фосфорилирования и действия на него разобщителей
- •Работа 41. Выявление гликолиза в мышечной ткани
- •Работа 42. Анализ адениннуклеотидов методом ионообменной тонкослойной хроматографии
- •Работа 43. Определение активности креатинфосфокиназы в сыворотке крови по Эннору и Розенбергу
- •Анализ пигментов и окислительных процессов фотосинтезирующих организмов
- •Работа 44. Качественные реакции на пигменты растений
- •Работа 45. Определение активности пероксидазы в растительном материале по методу а.Н.Бояркина
- •Обмен углеводов
- •Работа 46. Определение содержания глюкозы в крови
- •Работа 47. Количественное определение содержания глюкозы в крови глюкозооксидазным методом
- •Работа 48. Определение содержания молочной кислоты в крови по Баркеру и Саммерсону
- •Работа 49. Определение содержания пировиноградной кислоты в крови по Фридеману и Хаугену
- •Обмен липидов
- •Работа 50. Определение содержания суммарных липидов в сыворотке крови по реакции с сульфофосфованилиновым реактивом
- •Работа 51. Определение содержания β- и пре- β-липопротеидов сыворотки крови турбидиметрическим методом по Бурштейну и Самай
- •Работа 52. Определение содержания холестерина в сыворотке крови по методу Илька
- •Работа 53. Определение содержания общих фосфолипидов в сыворотке крови
- •Работа 54. Разделение липидов сыворотки крови методом тонкослойной хроматографии
- •Обмен белков и аминокислот
- •Работа 55. Определение содержания белковых фракций сыворотки крови турбидиметрическим методом
- •Работа 56. Определение активности катепсинов в сыворотке крови по а.А.Покровскому, а.И.Арчакову и о.Н.Любимцевой
- •Катепсины
- •Работа 57. Определение активности аспартат- и аланин- аминотрансферазы в сыворотке крови по Райтману и Френкелю
- •Работа 58. Определение активности гистидазы в сыворотке крови по Табору и Мелеру в модификации в.А.Буробина
- •Работа 59. Определение содержания свободного гидроксипролина в моче по Нейману и Логану в модификации п.Н.Шараева
- •Обмен азотсодержащих небелковых веществ
- •1. Исследование общих продуктов азотистого обмена
- •Работа 60. Количественное определение остаточного азота в крови фотоколориметрическим методом
- •Работа 61. Количественное определение мочевины в сыворотке крови и моче
- •Работа 62. Количественное определение креатина и креатинина по методу Брауна
- •2. Изучение обмена нуклеиновых кислот и нуклеотидов
- •Работа 63. Определение активности кислой дезоксирибонуклеазы (днКазы) в сыворотке крови по а.А.Покровскому, а.И.Арчакову и о.Н.Любимцевой
- •Работа 64. Определение содержания мочевой кислоты в сыворотке крови по методу Мюллера и Зейферта
- •3. Исследование порфиринового (пигментного) обмена
- •Работа 65. Определение билирубина и его фракций в сыворотке крови по Йендрашику, Клеггорну и Грофу
- •Молекулярная патология
- •1. Экспресс-диагностика патологии аминокислотного обмена Работа 66. Выявление гипераминоацидурии
- •Работа 67. Экспресс-методы диагностики фенилкетонурии
- •Работа 68. Диагностика тирозиноза пробой Миллона на тирозин
- •Работа 69. Выявление алкаптонурии пробой на гомогентизиновую кислоту
- •Работа 70. Выявление цистинурии иод-азидной пробой на цистин и гомоцистин в моче
- •2. Экспресс-диагностика патологий углеводного обмена Работа 71. Выявление пентозурии пробой Биаля
- •Работа 72. Выявление фруктозурии пробой Селиванова
- •Работа 73. Выявление мукополисахаридозов пробой с толуидиновым синим на мукополисахариды
- •Работа 74. Определение содержания порфобилиногена в моче
- •Работа 75. Количественное определение содержания дельта-аминолевулиновой кислоты в моче
- •Работа 76. Количественное определение содержания копропорфирина в моче по методу Соулсби в модификации Римингтона
- •Регуляторы обмена веществ
- •1. Исследование витаминов Работа 77. Качественные реакции на витамины
- •Работа 78. Определение содержания тиамина и рибофлавина флуориметрическим методом в поливитаминных препаратах
- •Работа 79. Количественное определение аскорбиновой кислоты в лекарственных растениях
- •2. Исследования гормонов, медиаторов и их метаболитов
- •Работа 80. Качественные реакции на белково-пептидные гормоны.
- •Работа 81. Качественные реакции на гормоны – производные аминокислот
- •Работа 82. Качественные реакции на стероидные гормоны и их метаболиты
- •Работа 83. Регуляция инсулином и адреналином уровня глюкозы в крови животных
- •Работа 84. Количественное определение гистамина в крови с диазотированным n-нитроанилином по н.В.Климкиной и с.И.Плитману
- •Исследование биологических жидкостей
- •1. Биохимические исследования крови Работа 85. Определение содержания гемоглобина в крови по его светопоглощению
- •Работа 86. Определение содержания фетального гемоглобина в эритроцитах крови человека
- •Работа 87. Определение содержания гликозилированного гемоглобина в эритроцитах крови фотоколориметрическим методом
- •Работа 88. Определение концентрации гаптоглобинов в сыворотке крови фотоколориметрическим методом
- •Работа 89. Проба Вельтмана в модификации Тейфеля на коллоидную устойчивость белков сыворотки крови
- •Работа 90. Определение активности α-амилазы в сыворотке крови амилокластическим методом
- •Работа 91. Определение содержания кальция в сыворотке крови мурексидным методом
- •Работа 92. Тимоловая проба по Хуэрго и Поппер
- •Работа 93. Сулемово-осадочная реакция
- •Работа 94. Количественное определение содержания железа в сыворотке крови
- •2. Биохимическое исследование мочи
- •Работа 95. Исследование физико-химических свойств мочи
- •Работа 96. Определение кетоновых тел и глюкозы в моче
- •Работа 97. Определение белка в моче по методу Бранденберга-Робертса-Стольникова
- •Работа 98. Качественное определение индикана в моче
- •Работа 99. Обнаружение некоторых пигментов в моче.
- •Метаболизм ксенобиотиков
- •Исследование процессов окисления и конъюгации ксенобиотиков Работа 100. Выявление дыхательной активности микросом
- •Работа 101. Исследование окислительного n-деметилирования в микросомах печени по Нашу
- •Работа 102. Определение гидроксилазной активности микросом печени по Като и Жилете
- •Работа 103. Метод оценки активности монооксигеназ эндоплазматической сети клеток печени по выделению метаболитов амидопирина с мочой по т.А.Попову и о.Д.Леоненко
- •Работа 104. Определение активности алкогольдегидрогеназы в сыворотке крови по Шкурски и др. С дополнениями и.В.Бокия, м.С.Усатенко и в.Ф.Трюфанова
- •Работа 105. Определение ацетилирующей способности организма по выделению с мочой свободной и ацетилированной форм сульфаниламидов по а.М.Тимофеевой в модификации г.А.Пономарева
- •Работа 106. Выявление ацетилирования (инактивации) гидразида изоникотиновой кислоты (гинк) в организме
- •Исследование пероксидного окисления липидов биологических мемебран
- •Работа 107. Определение чувствительности эритроцитов к пероксидному гемолизу
- •Работа 108. Определение скорости пероксидного окисления липидов в биомембранах
- •Приложение
- •2.Биохимические показатели плазмы крови
- •1.Общие клинические нормы
- •2. Специальное исследование мочи
- •Желудочный сок
- •2. Фосфатный буфер (0,1 м, рН 5,8-8,0)
- •3. Трис-буфер (0,1 м, рН 7,1-9,2)
- •4. Ацетатный буфер (0,2 м, рН 3,6-5,8)
- •5. Глициновый буфер (0,05 м, рН 8,6-10,6)
- •3. Приготовление некоторых реактивов
- •Оглавление
Построение калибровочного графика
В ряд пробирок (см. приложение) разливают калибровочный раствор диоксиацетона, доливают водой и далее проводят реакцию также, как и при определении активности фермента.
№ пробирки |
Калибровочный раствор диоксиацетона, мл |
Дистил. вода, мл |
Диоксиацетон в пробе, мкмоль |
Фруктозо-1,6-бис-фосфат в пробе, мкмоль |
1 |
0,05 |
0,45 |
0,5 |
0,25 |
2 |
0,10 |
0,40 |
1,0 |
0,50 |
3 |
0,20 |
0,30 |
2,0 |
1,0 |
4 |
0,30 |
0,20 |
3,0 |
1,5 |
5 |
0,40 |
0,10 |
4,0 |
2,0 |
Оформление работы. После определения активности фермента по полученным данным сделать вывод о возможных изменениях активности фермента и причинах этих отклонений.
Практическое значение работы. В норме активность фруктозо-1,6-бис-фосфатальдолазы составляет 3,6-21,8 мкмоль/ч∙л. Повышение активности фермента наблюдается при заболеваниях печени, поражении ее гепатотропными ядами, а также в случае нарушений со стороны сердечной и скелетной мышц (инфаркт миокарда, прогрессирующая мышечная дистрофия, миозит и т.д.).
Работа 23. Определение глюкозофосфат-изомеразы
(D-глюкозо-6-фосфат кетол-изомераза; КФ 5.3.1.9)
В сыворотке крови
Реактивы. Субстратная смесь для выявления глюкозофосфат-изомеразы*, трихлоруксусная кислота, 10%-ный раствор; резорцин, 0,1%-ный раствор в 3,6%-ной соляной кислоте; соляная кислота, 36%-ный раствор.
Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 5 мл; водяная баня; лабораторный термометр.
Материал. Сыворотка крови.
Метод основан на определении фруктозо-6-фосфата, образующегося в ходе изомеризации глюкозо-6-фосфата под действием глюкозофосфат-изомеразы:
Фруктозо-6-фосфат образует с резорцином в присутствии соляной кислоты соединение красного цвета.
Ход определения. В две пробирки вносят по 0,5 мл сыворотки крови. В одну из них (опытную) добавляют 1 мл субстратной смеси и перемешивают. Помещают обе пробирки на 30 мин в водяную баню при 37˚С, а по окончании инкубации в них приливают по 1,5 мл раствора трихлоруксусной кислоты (для остановки реакции). В контрольную пробу доливают 1 мл субстратной смеси.
После перемешивания содержимое каждой пробирки фильтруют через складчатый бумажный фильтр. Отбирают по 1 мл фильтрата в чистые пробирки, приливают по 1 мл резорцина и по 3 мл раствора соляной кислоты. Смеси энергично встряхивают и оставляют для развития окраски. Отмечают разницу окрашивания в пробах.
Оформление работы. Отметить различие окраски проб и сделать вывод о присутствии фермента в сыворотке крови.
3. Изучение кинетических свойств ферментов
Кинетика ферментативных реакций – это раздел энзимологии, который изучает зависимость скорости реакций, катализируемых ферментами, от химической природы реагирующих веществ (т.е. субстратов и ферментов) и от условий их взаимодействия, т.е. от температуры, концентрации компонентов, рН среды, состава среды, присутствия модификаторов и т.д. Изучение кинетики ферментативных реакций показывает не только их отличия от небиологических катализаторов, обусловленные прежде всего белковой природой ферментов, но и многообразие условий, от которых зависит правильное определение активности любого фермента.
Скорость реакции, т.е. убыль субстрата или прирост количества продукта за определенные промежутки времени, является мерой каталитической активности фермента или просто активностью фермента.
Использование методов качественного анализа субстратов и продуктов реакции позволяет выявить присутствие фермента в биологическом материале, а количественное определение их дает возможность определить содержание фермента или его активность в расчете на единицу массы или объема исследуемого образца.