- •Предисловие
- •Введение в биохимический практикум
- •I. Материал и его подготовка для биохимических исследований
- •2. Основные методы разделения и выделения веществ при биохимиеских иследованиях
- •3. Основные приборы, используемые в практикуме
- •Фотометрические приборы
- •Флуориметрические приборы
- •Центрифуги
- •Приборы для электрофореза
- •4. Применение единиц си для выражения результатов клинико-биохимических исследований Общие положения
- •Некоторые рекомендации по применению единиц си в клинико-биохимических исследованиях
- •1.Химическая природа простых белков
- •Работа 1. Качественные (цветные) реакции на функциональные группы белков и аминокислот
- •Работа 2. Качественный анализ некоторых белковых препаратов
- •Работа 3. Хроматографический метод разделения аминокислот
- •2. Исследование физико-химических свойств белков
- •Работа 4. Диализ белков
- •Работа 5. Определение изоэлектрической точки белка
- •Приготовление буферных систем для определения иэт казеина
- •Работа 6. Исследование денатурации белков
- •Работа 7. Исследование высаливания белков
- •3. Количественный анализ белков
- •Работа 8. Количественное определение белка в сыворотке крови
- •4. Состав и свойства сложных белков
- •Работа 9. Химическая природа гемпротеидов
- •Работа 10. Выявление углеводного компонента гликопротеидов
- •Работа 11. Качественные реакции на фосфопротеиды
- •Работа 12. Количественное определение содержания сиаловых кислот в сыворотке крови методом Гесса
- •Работа 13. Химическая природа нуклеопротеидов
- •Нуклеиновые кислоты
- •1. Исследование химической природы нуклеиновых кислот
- •Работа 14. Качественные реакции на компоненты нуклеиновых кислот
- •Количественные методы определения нуклеиновых кислот
- •Работа 15. Спектрофотометрический метод количественного определения нуклеиновых кислот по а.С.Спирину
- •Работа 16. Фотоколориметрические методы количественного определения нуклеиновых кислот
- •Работа 17. Исследование фосфолипидов
- •Работа 18. Качественные реакции на стероиды
- •Ферменты
- •Сравнительное действие ферментов и небиологических катализаторов
- •Работа 19. Сравнение действия α-амилазы слюны и соляной кислоты на реакцию гидролиза крахмала
- •2. Выявление ферментов, относящихся к разным классам
- •Работа 20. Обнаружение оксидоредуктаз в биологическом материале
- •Работа 21. Обнаружение холинэстеразы
- •В сыворотке крови экспресс-методом Херцфельда и Штумпфа
- •Работа 22. Определение активности фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы в сыворотке крови по методу в.И.Товарницкого и е.Н.Волуйской
- •Построение калибровочного графика
- •Работа 23. Определение глюкозофосфат-изомеразы
- •В сыворотке крови
- •3. Изучение кинетических свойств ферментов
- •Работа 24. Кинетика ферментативных реакций на примере α-амилазы слюны
- •4. Специфичность действия ферментов
- •Работа 25. Демонстрация абсолютной субстратной специфичности
- •5. Модификаторы активности ферментов
- •Работа 27. Активаторы и ингибиторы α-амилазы слюны
- •Мышечной ткани
- •Работа 29. Неконкурентное ингибирование каталазы крови
- •6. Количественное определение активности ферментов
- •Работа 30. Количественное исследование активности препарата лактатдегидрогеназы по Корнбергу
- •Работа 31. Фотоколориметрический метод исследования активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови по Севелу и Товареку
- •Работа 32. Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови по Боданскому
- •7. Исследование изоферментов
- •Работа 33. Разделение изоферментов лактатдегидрогеназы сыворотки крови методом электрофореза в полиакриламидном геле по Дитцу и Лубрано
- •Работа 34. Определение активности γ-глутамилтрансферазы в сыворотке крови
- •Биохимия пищеварения
- •Работа 35. Исследование кислотных компонентов желудочного сока
- •Работа 36. Определение кислотности желудочного сока диагностическим набором «Ацидотест»
- •Работа 37. Гидролиз белка ферментами пищеварительного тракта
- •Работа 38. Изучение динамики гидролиза триацилглицеринов под действием панкреатической липазы
- •Энергетический обмен (биоэнергетика)
- •1. Исследование процессов биологического окисления в животных тканях Работа 39. Обнаружение цитохромоксидазы в мышечной ткани
- •Работа 40. Демонстрация процесса окислительного фосфорилирования и действия на него разобщителей
- •Работа 41. Выявление гликолиза в мышечной ткани
- •Работа 42. Анализ адениннуклеотидов методом ионообменной тонкослойной хроматографии
- •Работа 43. Определение активности креатинфосфокиназы в сыворотке крови по Эннору и Розенбергу
- •Анализ пигментов и окислительных процессов фотосинтезирующих организмов
- •Работа 44. Качественные реакции на пигменты растений
- •Работа 45. Определение активности пероксидазы в растительном материале по методу а.Н.Бояркина
- •Обмен углеводов
- •Работа 46. Определение содержания глюкозы в крови
- •Работа 47. Количественное определение содержания глюкозы в крови глюкозооксидазным методом
- •Работа 48. Определение содержания молочной кислоты в крови по Баркеру и Саммерсону
- •Работа 49. Определение содержания пировиноградной кислоты в крови по Фридеману и Хаугену
- •Обмен липидов
- •Работа 50. Определение содержания суммарных липидов в сыворотке крови по реакции с сульфофосфованилиновым реактивом
- •Работа 51. Определение содержания β- и пре- β-липопротеидов сыворотки крови турбидиметрическим методом по Бурштейну и Самай
- •Работа 52. Определение содержания холестерина в сыворотке крови по методу Илька
- •Работа 53. Определение содержания общих фосфолипидов в сыворотке крови
- •Работа 54. Разделение липидов сыворотки крови методом тонкослойной хроматографии
- •Обмен белков и аминокислот
- •Работа 55. Определение содержания белковых фракций сыворотки крови турбидиметрическим методом
- •Работа 56. Определение активности катепсинов в сыворотке крови по а.А.Покровскому, а.И.Арчакову и о.Н.Любимцевой
- •Катепсины
- •Работа 57. Определение активности аспартат- и аланин- аминотрансферазы в сыворотке крови по Райтману и Френкелю
- •Работа 58. Определение активности гистидазы в сыворотке крови по Табору и Мелеру в модификации в.А.Буробина
- •Работа 59. Определение содержания свободного гидроксипролина в моче по Нейману и Логану в модификации п.Н.Шараева
- •Обмен азотсодержащих небелковых веществ
- •1. Исследование общих продуктов азотистого обмена
- •Работа 60. Количественное определение остаточного азота в крови фотоколориметрическим методом
- •Работа 61. Количественное определение мочевины в сыворотке крови и моче
- •Работа 62. Количественное определение креатина и креатинина по методу Брауна
- •2. Изучение обмена нуклеиновых кислот и нуклеотидов
- •Работа 63. Определение активности кислой дезоксирибонуклеазы (днКазы) в сыворотке крови по а.А.Покровскому, а.И.Арчакову и о.Н.Любимцевой
- •Работа 64. Определение содержания мочевой кислоты в сыворотке крови по методу Мюллера и Зейферта
- •3. Исследование порфиринового (пигментного) обмена
- •Работа 65. Определение билирубина и его фракций в сыворотке крови по Йендрашику, Клеггорну и Грофу
- •Молекулярная патология
- •1. Экспресс-диагностика патологии аминокислотного обмена Работа 66. Выявление гипераминоацидурии
- •Работа 67. Экспресс-методы диагностики фенилкетонурии
- •Работа 68. Диагностика тирозиноза пробой Миллона на тирозин
- •Работа 69. Выявление алкаптонурии пробой на гомогентизиновую кислоту
- •Работа 70. Выявление цистинурии иод-азидной пробой на цистин и гомоцистин в моче
- •2. Экспресс-диагностика патологий углеводного обмена Работа 71. Выявление пентозурии пробой Биаля
- •Работа 72. Выявление фруктозурии пробой Селиванова
- •Работа 73. Выявление мукополисахаридозов пробой с толуидиновым синим на мукополисахариды
- •Работа 74. Определение содержания порфобилиногена в моче
- •Работа 75. Количественное определение содержания дельта-аминолевулиновой кислоты в моче
- •Работа 76. Количественное определение содержания копропорфирина в моче по методу Соулсби в модификации Римингтона
- •Регуляторы обмена веществ
- •1. Исследование витаминов Работа 77. Качественные реакции на витамины
- •Работа 78. Определение содержания тиамина и рибофлавина флуориметрическим методом в поливитаминных препаратах
- •Работа 79. Количественное определение аскорбиновой кислоты в лекарственных растениях
- •2. Исследования гормонов, медиаторов и их метаболитов
- •Работа 80. Качественные реакции на белково-пептидные гормоны.
- •Работа 81. Качественные реакции на гормоны – производные аминокислот
- •Работа 82. Качественные реакции на стероидные гормоны и их метаболиты
- •Работа 83. Регуляция инсулином и адреналином уровня глюкозы в крови животных
- •Работа 84. Количественное определение гистамина в крови с диазотированным n-нитроанилином по н.В.Климкиной и с.И.Плитману
- •Исследование биологических жидкостей
- •1. Биохимические исследования крови Работа 85. Определение содержания гемоглобина в крови по его светопоглощению
- •Работа 86. Определение содержания фетального гемоглобина в эритроцитах крови человека
- •Работа 87. Определение содержания гликозилированного гемоглобина в эритроцитах крови фотоколориметрическим методом
- •Работа 88. Определение концентрации гаптоглобинов в сыворотке крови фотоколориметрическим методом
- •Работа 89. Проба Вельтмана в модификации Тейфеля на коллоидную устойчивость белков сыворотки крови
- •Работа 90. Определение активности α-амилазы в сыворотке крови амилокластическим методом
- •Работа 91. Определение содержания кальция в сыворотке крови мурексидным методом
- •Работа 92. Тимоловая проба по Хуэрго и Поппер
- •Работа 93. Сулемово-осадочная реакция
- •Работа 94. Количественное определение содержания железа в сыворотке крови
- •2. Биохимическое исследование мочи
- •Работа 95. Исследование физико-химических свойств мочи
- •Работа 96. Определение кетоновых тел и глюкозы в моче
- •Работа 97. Определение белка в моче по методу Бранденберга-Робертса-Стольникова
- •Работа 98. Качественное определение индикана в моче
- •Работа 99. Обнаружение некоторых пигментов в моче.
- •Метаболизм ксенобиотиков
- •Исследование процессов окисления и конъюгации ксенобиотиков Работа 100. Выявление дыхательной активности микросом
- •Работа 101. Исследование окислительного n-деметилирования в микросомах печени по Нашу
- •Работа 102. Определение гидроксилазной активности микросом печени по Като и Жилете
- •Работа 103. Метод оценки активности монооксигеназ эндоплазматической сети клеток печени по выделению метаболитов амидопирина с мочой по т.А.Попову и о.Д.Леоненко
- •Работа 104. Определение активности алкогольдегидрогеназы в сыворотке крови по Шкурски и др. С дополнениями и.В.Бокия, м.С.Усатенко и в.Ф.Трюфанова
- •Работа 105. Определение ацетилирующей способности организма по выделению с мочой свободной и ацетилированной форм сульфаниламидов по а.М.Тимофеевой в модификации г.А.Пономарева
- •Работа 106. Выявление ацетилирования (инактивации) гидразида изоникотиновой кислоты (гинк) в организме
- •Исследование пероксидного окисления липидов биологических мемебран
- •Работа 107. Определение чувствительности эритроцитов к пероксидному гемолизу
- •Работа 108. Определение скорости пероксидного окисления липидов в биомембранах
- •Приложение
- •2.Биохимические показатели плазмы крови
- •1.Общие клинические нормы
- •2. Специальное исследование мочи
- •Желудочный сок
- •2. Фосфатный буфер (0,1 м, рН 5,8-8,0)
- •3. Трис-буфер (0,1 м, рН 7,1-9,2)
- •4. Ацетатный буфер (0,2 м, рН 3,6-5,8)
- •5. Глициновый буфер (0,05 м, рН 8,6-10,6)
- •3. Приготовление некоторых реактивов
- •Оглавление
Работа 102. Определение гидроксилазной активности микросом печени по Като и Жилете
Реактивы. Трис-HCl буфер, 0,08 М раствор с рН 7,4*; хлорид магния, 0,16 М раствор; анилин перегнанный, 0,03 М раствор; трихлоруксусная кислота, 15%-ный раствор; карбонат натрия, 10%-ный раствор; фенол, 2%-ный раствор в 0,2 М растворе гидроксида натрия; НАДФ∙Н, 0,03 М раствор; биуретовый реактив*; гидроксид натрия, 3%-ный раствор; реактивы для выделения микросом, как в работе 86; 4-аминофенол, свежеприготовленный раствор для построения калибровочного графика. (5,45 мг/л).
Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1; 0,2; 1 и 5 мл; водяная баня; лабораторная центрифуга с центрифужными весами; центрифуга рефрижераторная ЦЛР; ФЭК типа КФК-2 или спектрофотометр.
Материал. Печень животного после забоя.
Метод основан на определении содержания 4-аминофенола, образующегося при гидроксилировании анилина в монооксигеназной цепи микросом и с участием цитохрома Р450:
4-аминофенол при взаимодействии с фенолом и в присутствии карбоната натрия образует окрашенный индофенольный комплекс синего цвета:
Ход определения. Выделяют фракцию микросом печени, как указано в работе 100, затем определяют содержание белка в полученной микросомальной фракции; для этого отбирают 0,05 мл взвеси микросом в пробирку, добавляют 3,95 мл раствора гидроксида натрия и 0.2 мл биуретового реактива. Перемешивают содержимое стеклянной палочкой и через 30 мин измеряют экстинкцию этого раствора против контрольного (4 мл гидроксида натрия и 0,2 мл биуретового реактива) на ФЭКе и СФ при 330 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Рассчитывают концентрацию белка по калибровочному графику (содержание белка в 0,1 мл взвеси микросом должно составлять примерно 2-4 мг).
Для изучения гидроксилирования анилина берут две чистые пробирки и готовят контрольную и опытную пробы. Последовательность внесения компонентов и их объем приведены в таблице.
Контроль |
Опыт | |||
вещество |
объем |
вещество |
объем | |
Трис-HCI буфер |
0,4 |
Трис-HCI буфер |
0,4 | |
Хлорид магния |
0,4 |
Хлорид магния |
0,4 | |
Взвесь микросом |
0,1 |
НАДФ∙Н |
0,2 | |
Трихлоруксусная кислота |
0,5 |
Взвесь микросом |
0,1 | |
Анилин |
0,11 |
Анилин |
0,11 | |
НАДФ∙Н |
0,2 |
|
|
Обе пробирки помещают на 20 мин в водяную баню при 37˚С, после чего в опытной пробе останавливают реакцию, приливая 0,5 мл трихлоруксусной кислоты. Далее обе пробы центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин.
Отбирают из каждой пробы по 1 мл надосадочной жидкости, переносят их в две другие пробирки. Затем приливают к ним по 0,5 мл карбоната натрия и по 1,5 мл раствора фенола. Перемешивают содержимое встряхиванием.
Для развития окраски пробирки помещают на 30 мин в водяную баню при 37˚С. Затем измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной на ФЭКе или СФ при 630 нм (светофильтр красный).
Серию растворов для построения калибровочного графика готовят согласно таблице.
№ пробирки |
4-аминофенол, мл |
Вода, мл |
Nа2СО3, мл |
Фенол, мл |
Содержание 4-аминофенола в пробе, нмоль |
1 |
0,1 |
0,9 |
0,5 |
1,5 |
5,0 |
2 |
0,2 |
0,8 |
0,5 |
1,5 |
10,0 |
3 |
0,3 |
0,7 |
0,5 |
1,5 |
15,0 |
4 |
0,4 |
0,6 |
0,5 |
1,5 |
20,0 |
5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
1,5 |
25,0 |
6 |
0 |
1,0 |
0,5 |
1,5 |
0 (контроль) |
Затем пробирки ставят на 30 мин в водяную баню при 37˚С. Измеряют экстинкцию проб против контроля, как описано выше, и строят калибровочный график.
Расчет проводят по формуле
АV
х = ——— ,
20m
где х – гидроксилазная активность нмоль/(мин∙мг белка);
А – содержание 4-аминофенола в пробе, найденное по калибровочному графику, нмоль;
V – объем пробы, равный 1,71 мл;
20 – время инкубации, мин;
m – содержание белка в пробе, мг.
Практическое значение работы. Для изучения функции микросомальной цепи окисления печени в норме и особенно при патологических состояниях используют различные методические подходы. В частности, исследования проводят с разными субстратами, превращение которых происходит на цитохроме Р450. При взаимодействии с цитохромом Р450 разные субстраты дают неодинаковые спектры поглощения. По этому признаку их условно делят на субстраты I типа (к ним относятся, например, амидопирин, бензфетамин, этилморфин и др.) и II типа (анилин), что связано, возможно, с некоторыми различиями в механизме гидроксилирования данных соединений.
Скорость реакций гидроксилирования изменяется при действии многих внешних факторов (радиации, гипероксии, гипоксии, интоксикации четыреххлористым углеродом и т.д.), под влиянием ряда регуляторов (витаминов, гормонов). Для получения более полной информации о деятельности гидроксилазной активности микросом печени при действии многих факторов и при патологии используют разные ксенобиотики – субстраты цитохрома Р450.