Лабораторная работа №3 Генетические рекомбинации у микроорганизмов

I. Вопросы для обсуждения.

1. Внехромосомные факторы наследственности.

2. Трансформация, конъюгация, трансдукция.

3. Контрольная работа по теме “Генетика микроорганизмов ”.

II. Работа, выполняемая студентами.

1. Учет результатов предыдущего занятия.

После обработки мутагеном необходимо определить выживаемость клеток дрожжей под влиянием: а) УФ- облучения; б) мутагена ( Н₂О₂)

Для этого подсчитывают среднее количество колоний, выросших на одной контрольной чашке Петри, затем количество колоний на опытных чашках (в том же разведении взвеси). Среднее количество колоний в контроле принимают за 100%. Составляют пропорцию, подсчитывают процент выживаемости. Подсчитывают также морфологическую изменчивость (по наличию морфологически измененных, отличающихся от контрольных, колоний) в процентах к общему числу просмотренных колоний, результаты вносят в таблицы.

Таблица 1

Летальное действие мутагенов на

Мутаген	Длительность воздействия мутагена	Количество колоний на чашке при разведении			Количество жизнеспособных клеток в мл	Выживаемость, %
		1:100	1:1000	1:10000
Контроль Н2О2 УФЛ

Таблица 2

Изменчивость под действием мутагенов

Мутаген	Длительность воздействия мутагена	Общее число колоний на чашках	Количество морфологически измененных колоний	Изменчивость, %
Контроль Н2О2 УФЛ

Примечание. При подсчете летального эффекта с учетом разведения помнить о разведении водой и Н₂О₂ 1:6. В опыте с УФЛ это разведение отсутствует.

2. Постановка опыта специфической трансдукции.

Реципиент – культура E. сoli lac^- (не способна ферментировать лактозу, поэтому образует на среде Эндо бесцветные колонии ). Фаг лямбда dgal⁺-

несет β-галактозидазный оперон, контролирующий ферментацию лактозы.

Селективная среда – среда Эндо, на которой E. сoli, ферментирующая лакто

зу, образует красные колонии с металлическим блеском.

К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиента добавляют 1 мл фага в концентрации 10⁶-10⁷ частиц в мл. Смесь инкубируют при температуре 37⁰С в течение 30 мин, после чего высевают на среду Эндо.

На следующем занятии подсчитывают число колоний на чашках и опредляют частоту трансдукции.

3. Постановка опыта трансформации.

Реципиент – культура золотистого стафилококка (чувствительная к стрептомицину) Str^s.

Раствор ДНК выделен из культуры донора, устойчивого к стрептомицину (Str^r).

Селективная среда – МПА, содержащий 100 ед/мл стрептомицина. Чашку Петри с селективной средой делят на два сектора; на один из них сеют (штрихами) исходную культуру стафилококка ( контроль)

К 1 мл суточной бульонной культуры стафилококка добавляют 1 мкг ДНК донора в 1 мл раствора. Смесь инкубируют в течение 30 мин при температуре 37⁰С. Затем полученную смесь высевают на второй сектор чашки Петри с селективной средой (опыт) . На следующем занятии учитывают образование рекомбинантов (трансформантов).

4. Посев почвы для выявления аммонифицирующих бактерий.

В МПБ ( 5 мл в пробирке) внести по 0,5 мл посевного материала - взвесь

почвы ,разведенной 1:100. После посева между горлышком и пробкой

пробирки укрепить полоски индикаторных бумажек (на аммиак, сероводо

род, индол). Условия культивирования – 5-7 суток при 28-30⁰С. Работу

выполняет бригада из 3-х студентов.

5. Продолжение задачи 1. Этап III – изучение физиолого-биохимических свойств выделенных бактерий.

5. 1. Окрасить культуру по Граму, убедиться в ее чистоте.

5. 2. Посев культуры на “пестрый ряд”.

1. Среды для кокков

Среда Гисса с глюкозой

МПБ

2. Среды для грамотрицательных палочек

Среда Гисса с лактозой

Среда Гисса с глюкозой

Пептонная вода с индикаторными бумажками на H₂S, NH₃ и индол

3. Среды для грамположительных палочек

Среда Гисса с глюкозой

Пептонная вода с индикаторными бумажками на H₂S и индол

5.3 Определение каталазной активности. Культуру вносят петлей в каплю 3%

Н₂О₂на предметном стекле; наблюдают выделение О₂

.

5.4 Определение амилазной активности . На чашку Петри с МПА и крахмалом

произвести посев культуры штрихом (выращивать при 37⁰С 24 ч).

5.5. Определение размеров клеток бактерий.