исследуемого материала. Они предотвращают отмирание патогенных микроорганизмов и подавляют развитие сапрофитов. К ним относятся глицериновая смесь(2 части 0,85 % NaCl, 1 часть глицерина, 1 часть 15-20 % Na3PO4), глицериновый консервант с солями Li, гипертонический раствор NaCl.

5. Особые питательные среды применяются для культивирования патогенных спирохет и простейших. Они содержат нативные белки(сыворотку или кровь), кусочки свежих органов и тканей (почки кролика, мозговая ткань кур); либо применяют синтетические питательные среды с определенным набором аминокислот.

Задача 9. ОПИСАТЬ ПРИГОТОВЛЕНИЕ ИСКУССТВЕННЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД.

Для этого надо знать:

1. МПБ готовят на мясной воде. 1 кг мясного фарша заливают 2 л водопроводной воды (она содержит минеральные соли в необходимом для бактерий количестве) и настаивают 24 часа в прохладном месте. Настой кипятят 1 час, остужают, фильтруют до прозрачности, разливают в бутыли и стерилизуют в автоклаве.

К мясной воде добавляют 1 % пептона, 0,5 % NaCl (для создания изотоничности), устанавливают рН (для большинства рН= 7,2-7,6). Затем кипятят 30 мин, добавляют дистиллированную воду до первоначального объема, фильтруют, еще раз устанавливают рН, разливают по пробиркам и колбам и стерилизуют в автоклаве при 120° С.

2. МПА готовят на основе МПБ. К МПБ добавляют 1,5-2 % сухого агара, кипятят до его полного растворения, фильтруют в горячем виде, проверяют рН, разливают по пробиркам и колбам и стерилизуют в автоклаве при 120° С.

Для получения большей поверхности культивирования готовят так называемый косой агар. Для этого пробирки сразу после стерилизации укладывают остывать в наклонном положении. При остывании агар отдает конденсационную воду, собирающуюся внизу пробирки.

3. ПВ – наиболее простая по химическому составу питательная среда. Для приготовления этой среды 1 % пептона и 0,5 % NaCl растворяют в дистиллированной воде, фильтруют и стерилизуют в автоклаве при 120° С.

4. Сложные питательные среды готовят на основе простых. Сахарные среды готовят, добавляя к МПБ или МПА1 % глюкозу. Стерилизуют в аппарате Коха при100° С дробным методом.

Сывороточные среды готовят, добавляя к МПБ или МПА 10-20 % стерильной сыворотки (бычьей, лошадиной и др.). МПА предварительно расплавляют на кипящей водяной бане, а затем остужают до 45-50° С и добавляют сыворотку. Сывороточные среды нельзя подвергать стерилизации, и необходимо контролировать их стерильность(ставят в термостат на 3 дня).

Для приготовления кровяного агара стерильно взятую дефибринированную кровь (кролика, барана и др.) прибавляют к стерильному расплавленному и остуженному до 45° С МПА в количестве5-20 %, тщательно перемешивают, избегая образования пузырьков, разливают в стерильные чашки Петри или пробирки. Среду также нельзя под-

11

вергать стерилизации.

5.Приготовление других сред осуществляется по специальным рецептам. Диффе- ренциально-диагностические среды из сухих порошков готовят следующим образом: навеску среды растворяют в дистиллированной воде и после5-минутного кипячения разливают в стерильные чашки Петри.

6.Для контроля стерильности среды помещают в термостат при37° С на 5 суток. Жидкие среды должны быть прозрачными, а на поверхности и в толще плотных питательных сред не должны появляться признаки роста.

Проводят также химический контроль сред(проверяют рН, содержание общего и аминного азота, хлоридов) и биологический контроль (изучают рост лабораторной культуры того микроорганизма, для которого приготовлена среда). Только после того, как среды выдержали контроль, их можно использовать по назначению.

Задача 10. ДАТЬ ПОНЯТИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ, КОЛОНИИ, КЛОНА, ШТАММА.

Для этого надо знать:

1.Чистая культура микроорганизмов – это популяция клеток (видимый рост) одного вида, выросшая на стерильной питательной среде.

2.При размножении бактерий на плотной питательной среде можно наблюдать образование колоний. Колония – это макроскопическое скопление бактериальных клеток, которые являются потомством одной бактериальной клетки. Следовательно, все клетки, входящие в состав одной колонии, принадлежат к одному виду. Колонии различаются по размеру, форме, строению, консистенции и цвету. Внешний вид колоний характерен для определенного вида бактерий.

3.В микробиологии широко применяются термины "штамм" и "клон". Штаммы – это разные микробные культуры одного вида, выделенные из различных источников или даже из одного и того же источника, но в разное время. Штаммы одного вида могут быть совершенно идентичными или различаться по отдельным признакам(устойчивость к антибиотику, ферментация какого-либо сахара и т.д.). Если возбудитель выделен из воды, говорят о водном штамме; из испражнений – фекальном штамме. Вирус гриппа, выделенный в Гонконге, получил название "штамм Гонконг", а в Сингапуре – "штамм Сингапур". Часто штаммы обозначают протокольными номерами.

4.В научно-исследовательской работе, особенно при генетических исследованиях, необходимо получать культуру заведомо из одной клетки. Такая культура называется клоном. Для ее получения пользуются микроманипулятором. Это прибор, снабженный инструментами (иглами, пипетками) микроскопических размеров. С помощью держателя под контролем микроскопа их вводят в препарат"висячая капля" и нужную клетку (одну!) переносят в питательную среду. Она размножается и образует клон генетически идентичных клеток.

12

Задача 11. ОПИСАТЬ ПРИНЦИПЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ.

Для этого надо знать:

1.Выделение чистой культуры является основой бактериологической работы, т.к. в практической деятельности приходится иметь дело с материалом, содержащим смесь микробов (гной, испражнения и т.д.), идентификация же вида возможна только тогда, когда бактерии получены в чистом, изолированном виде.

2.Для получения чистой культуры необходимо отделить бактериальные клетки разных видов друг от друга. По способу их отделения различают две основные группы методов выделения чистых культур: а) методы, основанные на механическом разделении; б) методы основанные на различиях в биологических свойствах микроорганизмов.

3.Чаще всего используются механические способыразъединения бактериальных клеток – специальные методы посева:

а) рассев шпателем по Дригальскому: берут три чашки Петри с питательным агаром; на первую чашку наносят петлей или пипеткой каплю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности агара; затем шпатель переносят во вторую чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды; аналогичным образом производят посев шпателем и в третьей чашке. На первой чашке вырастает максимальное количество колоний; на третьей – минимальное, где вырастают отдельные колонии, пригодные для выделения чистой культуры;

б) рассев петлей ("штрихами" или "сеткой"): берут одну чашку Петри с питательным агаром; петлей на небольшом участке питательного агара делают сплошной посев исследуемого материала, а затем, отступив от засеянной площадки, делают посев прерывистыми штрихами; в том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост будет в виде сплошного штриха, а на штрихах с небольшим количеством клеток вырастут отдельные колонии;

в) фильтрация: исследуемый материал пропускают через специальные фильтры с определенным диаметром пор и таким образом разделяют микроорганизмы по величине (в основном применяется для очистки вирусов от бактерий).

Т.о., при помощи специальных методов посева добиваются роста микроорганизмов на плотных питательных средах в виде изолированных колонийразличных видов бактерий, содержащихся в исходном материале в виде смеси, т.е. получают чистую культуру из одной клетки, а далее осуществляют ее пересев.

4.Биологические способы выделения основаны на различиях в биологических свойствах микроорганизмов:

а) метод Шукевича – исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного агара, подвижные формы микробов при размножении как бы"вползают" на поверхность агара из конденсационной воды(Proteus vulgaris), отсевая верхние края культуры в воду свежескошенного агара, и, повторяя это несколько раз, можно получить чистую культуру;

б) метод прогревания – прогревают материал при 80° С на водяной бане10-15

13

минут, при этом вегетативные формы погибают, а споры остаются и при посеве на соответствующую питательную среду прорастают (этот метод позволяет отделить споровые формы от неспоровых);

в) бактериостатический метод – при посеве в исходный материал добавляют некоторые химические вещества или антибиотики, которые угнетают рост одних микроорганизмов, не влияя на другие(например, пенициллин задерживает рост грамположительных микроорганизмов, не влияя на грамотрицательные; 5 % р-р H2SO4 убивает большинство микроорганизмов, а туберкулезная палочка выживает);

г) метод обогащения – посев на элективные питательные среды; д) метод заражения лабораторных животных или растений – заражают исследуе-

мым материалом восприимчивые к возбудителю виды животных или растений; после появления признаков заболевания производят посев органов и тканей на питательные среды (применяют для выделения патогенных видов микроорганизмов и отделения их от сапрофитов).

5.Для выделения чистых культур большинства бактерий обычно затрачивается не более 2-3 суток (для выращивания микобактерий туберкулеза – 4-6 недель). Процесс выделения чистой культуры можно разделить на три этапа: а) отделение чистой культуры; б) накопление чистой культуры; в) идентификация – заключение о видовой принадлежности.

6.Первый этап (1-ый день):

а) из исследуемого материала готовят мазо,кокрашивают по Граму (или другим методом) и микроскопируют;

б) производят посев исследуемого материала (смеси бактерий) на чашку Петри с МПА штриховым методом или по методу Дригальского и ставят в термостат при37° С на 24-48 часов (на этом этапе можно использовать и какой-либо биологический способ).

Второй этап (2-ой день):

а) наблюдают результаты посева и проводят описание колонийразных видов по следующим признакам: размер, форма, цвет, поверхность, форма края, структура, консистенция;

б) из колоний готовят мазки и окрашивают по Граму для изучения морфологических и тинкториальных свойств; убеждаются в том, что колония содержит один вид бактерий;

в) осуществляют пересев одной или нескольких различных изолированных колоний в отдельные пробирки со скошенным МПА для накопления чистой культуры; выращивают в термостате при 37° С 24 часа.

Третий этап (3-ий день):

а) отмечают характер роста выделенной чистой культуры на МПА(визуально она характеризуется однородным ростом);

б) готовят мазок, окрашивают по Граму (или другим методом) и микроскопируют; при наличии чистой культуры обнаруживаются морфологически и тинкториально однородные клетки (исключение – полиморфные организмы);

в) производят посев на жидкие и полужидкие среды Гисса и МПБ для изучения

14