6. Реакция паули (диазореакция)
Раствор белка, содержащий в своем составе аминокислоты тирозин и гистидин, при обработке диазореактивом в щелочной среде образует окрашенное в оранжевый цвет соединение.
Реакция обусловлена тем, что названные выше аминокислоты имеют подвижные атомы в ароматической части радикала, за счет которых они и вступают в реакцию азосочетания с диазотированной сульфаниловой кислотой (диазореактивом).
Образованием азосоединения и обусловлено появление окраски. Протекающие при этом реакции можно записать следующим образом:
Ход работы: К 4-5 каплям раствора белка добавляют 4 капли раствора соды и 8-10 капель диазореактива. Образуется азосоединение оранжевого цвета.
7. Реакция сакагуши
Эта реакция обнаруживает в белке аминокислоту аргинин, которая в присутствии гипобромита (NаВrO) теряет аминогруппу, а продукт окисления конденсируется с ά-нафтолом, образуя вещество красного цвета.
Происходящие при этом реакции можно представить следующей схемой:
Ход работы: К 1 мл раствора белка добавляют 0,5 мл 10%-ного раствора едкого натра, 0,5 мл 0,1%-ного раствора ά-нафтола и содержимое пробирки перемешивают.
Добавляют 0,5 мл раствора гипобромита натрия и наблюдают появление продукта конденсации красного цвета.
8. Нингидриновая реакция
Реакция нингидрина с аминокислотами используется для обнаружения и количественного определения аминокислот.
Нингидрин, являющийся сильным окислителем, вызывает окислительное дезаминирование аминокислот, приводящее к образованию СО2, соответствующего альдегида и восстановленной формы нингидрина (1).
Восстановленная форма нингидрина реагирует с избытком нингидрина и NН3. При этом образуется продукт сине-фиолетового цвета (2). Протекающие реакции можно записать следующим образом:
гидриндантин (1)
продукт конденсации фиолетового цвета (2)
Ход работы: К 1 мл белка добавляют 2 мл водного 1% р-ра нингидрина и кипятят. Образуется осадок сине-фиолетового цвета.
Материал исследования и реактивы
1. 1 % раствор яичного белка.
2. Водный раствор исследуемого белка.
3. NаОН, 10%-ный раствор, 30%-ный раствор.
4. СuSO4, 1%-ный раствор.
5. Азотная кислота, конц.
6. Реактив Миллона: в 57 мл конц. HNO3 растворяют 40 г ртути сначала на холоду, а затем слабо нагревая на водяной бане. Полученный раствор разбавляют двумя объемами воды, дают отстояться и сливают с осадками.
7. СНзСООН, конц.
8. Уксуснокислый свинец, 5-10%-ный раствор.
9. Nа2СO3, 10%-ный раствор.
10. NН4ОН, конц.
11. ά-нафтол, 0,1 %-ный раствор.
12. Гипобромит натрия.
13. Диазореактив.
14. Н2SO4, конц.
Лабораторная работа № 2 реакции осаждения белков. Высаливание белков
1. Высаливание белков сульфатом аммония.
Важным фактором устойчивости белков в растворе является наличие около частиц белка гидратной оболочки. Если к раствору белка прибавить соль, например (NH4)2SO4, Na2SO4, NaCl и др., то вследствие разрушения водных оболочек частицы белка обычно слипаются друг с другом, укрупняются и выпадают в осадок. Разные белки высаливаются при неодинаковых концентрациях одних и тех же солей. Глобулины, например, осаждаются в полунасыщенном растворе сернокислого аммония, тогда как альбумины — в насыщенном растворе этой соли. Высаливание белков является обратимой реакцией. Денатурации белков при этом не происходит.
Ход работы: Наливают в пробирку 1-1,5 мл раствора белка, добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония. Наблюдают выпадение белого хлопьевидного осадка глобулинов. Мутную жидкость фильтруют через сухой складчатый фильтр. К фильтрату добавляют при перемешивании избыток сульфата аммония в порошке до прекращения его растворения. Появляется муть или хлопья выпадающих в осадок альбуминов. К осадку добавляют 2-3 кратное по объему количество воды и убеждаются в способности осадка к растворению.
2. Осаждение белков спиртом.
Спирт дегидратирует белки, вследствие чего происходит их коагуляция, агрегация и осаждение. Реакция осаждения белков спиртом при непродолжительном контакте его с белком обратима.
Ход работы: В пробирку наливают около 2 мл раствора белка, добавляют несколько кристалликов NaCl и по каплям этиловый спирт до образования хлопьев. После оседания хлопьев белка, сливают жидкость над ними, к осадку приливают воду, наблюдая растворение белка.
3. Осаждение белков солями тяжелых металлов.
Соли тяжелых металлов, например СuSO4, HgCl2, (CH3COOH)2Pb др., осаждают белки из растворов необратимо, что связано с образованием белково-металлических нерастворимых в воде комплексных соединений. При этом белки денатурируют. Структуры белка (кроме первичной) полностью разрушаются. Такой белок теряет способность выполнения свойственной ему функции. Изменяются при этом и физико-химические его свойства, белок теряет свою растворимость. Процесс денатурации, как правило, необратим.
Ход работы: В пробирку наливают около 2 мл раствора белка и прибавляют медленно по каплям раствор соли тяжелого металла (1%-ного раствора сульфата меди или 5%-ного раствора ацетата свинца).
Наблюдают коагуляцию белка. Выпавшие хлопья от прибавления воды не растворяются.
4. Осаждение белков органическими кислотами.
Трихлоруксусная кислота является специфическим реактивом на белок. Она осаждает только белки и не осаждает продукты распада белка и аминокислоты, поэтому ею пользуются для полного удаления белков из биологических жидкостей (например, сыворотки крови, молока). В этих условиях продукты распада белков остаются в растворе.
Ход работы: В пробирку наливают 2-3 мл раствора белка и добавляют несколько капель 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. Наблюдают выпадение осадка белка.
5. Осаждение белков при нагревании.
При нагревании белки денатурируют. Денатурация сопровождается изменением структуры белковых молекул с нарушением соотношения гидрофильных и гидрофобных групп в сторону увеличения последних. Такое изменение структуры молекул приводит к потере нативных свойств белка, в том числе к потере его растворимости.
В пробирку наливают 3-5 мл раствора яичного белка, вставляют в нее термометр и раствор нагревают до образования хлопьев. Замечают, при какой температуре образовались хлопья. Проверяют реакцию на обратимость.
Белок не выпадает в осадок, если среда, в которой он растворен, будет сильнокислая или сильнощелочная. Белковая молекула будет нести определенный заряд — положительный в кислой среде и отрицательный — в щелочной среде. При этом устойчивость белка повышается в результате электростатических сил отталкивания, и белок не выпадает в осадок.
Ход работы: В четыре пробирки налить раствор белка. Во вторую добавить несколько капель разведенной уксусной кислоты, в третью — крепкой ледяной уксусной кислоты, в четвертую — несколько капель щелочи. Все четыре пробирки прокипятить. Отметить изменения.
Пробирку с крепкой уксусной кислотой осторожно нейтрализовать щелочью, отметив изменения.