- •240902.65 “Пищевая биотехнология”, 110901.65 “Водные биоресурсы и аквакультура”, 080401.65 “Товароведение и экспертиза товаров",
- •260100.62 “Технология продуктов питания”.
- •Часть I
- •Содержание
- •Основные правила безопасности при работе в биохимической лаборатории
- •Правила техники безопасности при работе с кислотами и щелочами
- •Правила техники безопасности при работе с бромом
- •Техника безопасности при работе с легковоспламеняющимися жидкостями
- •Техника безопасности при работе под вакуумом
- •Меры безопасности при утечке газа и тушении локального пожара и горящей одежды
- •Оказание первой медицинской помощи при ожогах и отравлениях химическими веществами
- •Лабораторная работа № 1 цветные реакции на белки
- •1. Биуретовая реакция
- •2. Ксантопротеиновая реакция
- •3. Реакция миллона
- •4. Реакция адамкевича
- •5. Реакция на серу в белках (реакция фоля)
- •6. Реакция паули (диазореакция)
- •7. Реакция сакагуши
- •8. Нингидриновая реакция
- •Материал исследования и реактивы
- •Лабораторная работа № 2 реакции осаждения белков. Высаливание белков
- •Материал исследования и реактивы
- •Лабораторная работа № 3 разделение аминокислот методом хроматографии на бумаге
- •Материалы исследования и реактивы
- •Оборудование
- •Лабораторная работа № 4
- •Материалы исследования и реактивы
- •Лабораторная работа № 5 определение аминного азота методом формольного титрования
- •Лабораторная работа № 6 сложные белки
- •1. Нуклеопротеиды
- •2. Фосфопротеиды
- •3. Гликопротеиды
- •Исследуемый материал и реактивы
Материалы исследования и реактивы
1. Смесь аминокислот. Аминокислоты растворяют в концентрации около 0,04 М. Можно использовать следующие сочетания аминокислот:
а/глютаминовая кислота - 60 мг, аланин - 40 мг, лейцин - 50 мг; б/глютаминовая кислота - 60 мг, глицин - 40 мг, аланин - 40 мг; в/аспарагиновая кислота - 60 мг, серии - 40 мг, лейцин - 60 мг; г/аспарагиновая кислота - 60 мг, глицин - 40 мг, лейцин - 60 мг.
Указанное количество кислот растворяют в 10 мл воды. Для ускорения растворения аминокислот можно растворять их при нагревании.
2. Нингидрин, 0,5% раствор в ацетоне
3. Бутанол
4. Уксусная кислота ледяная.
Оборудование
1. Сушильный шкаф
2. Пульверизаторы
3. Хроматографические камеры
4. Хроматографическая бумага
5. Стеклянные пластинки и палочки.
Лабораторная работа № 4
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА ПО МЕТОДУ ЛОУРИ
Метод основан на измерении интенсивности окраски, которую дает раствор белка в цветных реакциях: биуретовой и реакции Фолина.
При взаимодействии белка со щелочным раствором медного купороса образуются комплексные соединения (биуретовая реакция), которые своими тирозиновыми и цистеиновыми радикалами восстанавливают смесь фосфорно-вольфрамовой и фосфорно-молибденовой кислот с образованием комплексного соединения синего цвета (реакция Фолина). Интенсивность окраски комплекса, которая зависит от количества белка в исследуемой пробе, измеряется на фотоэлектроколориметре с красным фильтром. В работе используются следующие реактивы:
А – 2% раствор Na2CO3 0,1N NaOH
В – 0,5% раствор СuSO4*5H2O в 1% растворе винно-кислого среднего Na,K.
С – щелочной раствор меди, полученный сливанием 50 мл реактива А и 1 мл реактива В (в день определения).
Е – реактив Фолина (приготовленный разводят в 2 раза). Для приготовления реактива Фолина 100 г Na2WO4*2H2O и 25 г Na2MoO4*2H2O растворяют в 700 мл воды в круглодонной колбе на 1 л, снабженной пришлифованным холодильником Либиха. Прибавляют 50 мл 85% фосфорной кислоты и 100 мл соляной кислоты (конц.). Помещают в колбу несколько капилляров. Смесь кипятят в колбе с обратным холодильником в течение 10 часов. Далее прибавляют 150 г сульфата лития, 50 мл воды и несколько капель брома. Не пользуясь более обратным холодильником, кипятят содержимое колбы в течение 15 минут для удаления избытка брома (под тягой). Раствор охлаждают, доводят водой до объема 1 л и фильтруют через стеклянный фильтр.
Хранят реактив Фолина в склянке из темного стекла.
Построение калибровочного графика: Чтобы определить содержание белка в исследуемой пробе, необходимо построить калибровочный график. Для построения калибровочного графика используют ряд растворов бычьего альбумина с известными концентрациями. Для этого берут 10 мг альбумина растворяют в 10 мл воды из этого раствора берут 2 мл и доводят водой до 10 мл, концентрация полученного исходного раствора белка – 200 мг/мл. Из этого раствора готовят разбавленные растворы. Для этого наливают в пробирку указанное в таблице количество белка и воды.
К 1 мл каждого разбавленного раствора добавляют 5 мл реактива С. Смесь перемешивают и через 10 минут приливают к ней 0,5 мл раствора Е. Через 30 минут измеряют оптическую плотность каждого раствора на ФЭКе с красным светофильтром и строят калибровочный график, откладывая по горизонтальной оси (абсциссе) известные концентрации, а по вертикальной оси (ординате) соответственно значения оптической плотности (рис.2).
Рис.2. Калибровочный график, построенный по стандартным раствором белка
Приготовление разбавленных растворов
№ пробирки |
Концентрация р-ра белка (мкг в 1 мл) |
Кол-во исходного р-ра белка в мл |
Кол-во H2Oв мл |
1 |
40 |
0.2 |
0.8 |
2 |
60 |
0.3 |
0.7 |
3 |
80 |
0.4 |
0.6 |
4 |
100 |
0.5 |
0.5 |
5 |
120 |
0.6 |
0.4 |
6 |
140 |
0.7 |
0.3 |
7 |
160 |
0.8 |
0.2 |
Для определения концентрации белка к 1 мл исследуемого раствора белка добавляют реактивы С и Е в таком же количестве и порядке, как и при построении калибровочной кривой и находят оптическую плотность этого раствора. Найденную величину оптической плотности исследуемого раствора белка откладывают на оси ординат и проводят прямую линию параллельно оси абсцисс до пересечения с калибровочной кривой. Из точки пересечения проводят линию параллельно оси ординат. В точке пересечения с осью абсцисс находят концентрацию белка, соответствующую данной оптической плотности раствора.