Температура культивирования

Оптимальная температура роста патогенных для человека микроорганизмов совпадает в основном с температурой тела человека. В отдельных случаях температурный параметр может быть использован как простой способ селекции, например, виды Campylobacterлучше растут при температуре 42ºС, слишком высокой для роста большинства других патогенов. В зависимости от требований к температурному режиму бактерии классифицируются на психрофилы, термофилы и мезофилы.

Мезофильные бактерии лучше всего растут в пределах 20-40ºС, к ним относится большинство патогенных для человека микроорганизмов.

Термофильные бактерии лучше растут при 50-60ºС.

Психрофильные бактерии предпочитают расти в интервале температур от 0 до 10 ºС.

Состав газовой среды

Бактерии четко разделяют по отношению к содержанию кислорода в атмосфере культивирования.

Аэробы.Посевы аэробных бактерий культивируют в простых термостатах. Некоторые факультативно-анаэробные виды можно культивировать при атмосферном воздухе, но более оптимально помещение посевов в термостаты с дозированной подачей кислорода. На практике их чаще помещают в эксикаторы, куда вносят горящую свечу; после ее выгорания в атмосфере снижается содержание кислорода и повышается содержание углекислого газа.

Анаэробы.Посевы анаэробных бактерий в жидких средах заливают вазелиновым маслом. При использовании плотных сред посевы культивируют в специальных устройствах – анаэростатах или микроанаэростатах, где создается бескислородная атмосфера физическими или химическими способами.

Культуральные свойства

После культивирования осуществляют культуральные свойства бактерий. Культуральными свойствами микроорганизмов называется характер их роста на плотных и жидких питательных средах. Изучение культуральных свойств проводят макроскопически в проходящем и отраженном свете и микроскопически, учитывая следующие характеристики: размер, форма, характер края, характер поверхности, консистенция, внутренняя структура и дается заключение о генетической форме колонии – S-форма (округлая, гладкая, влажная, с ровными краями, однородной внутренней структуры) иR-форма (шероховатая, с неровными краями, сухая, неоднородной внутренней структурой).

Из части колонии готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии однородных бактерий остаток колонии пересевают на скошенный агар, для накопления чистой культуры в достаточном для последующей идентификации количестве.

Идентификация

Идентификация – определение (установление) видовой принадлежности микроорганизма. В настоящее время общепринятый метод идентификации основан на изучении определенного набора наиболее важных фенотипических признаков исследуемой бактерии. Критерием для идентификации является наличие у микроорганизма совокупности основных признаков, характерных для данного вида (таксономических признаков). Установление вида производится согласно международной таксономической классификации Берги (Bergey’sManualofSystematicBacteriology).

Основными видами идентификации являются:

1. Изучение морфологических свойств (форма, расположение), тинкториальных (особенности окрашивания с помощью простых и сложных методов окраски), культуральных (особенности роста на питательных средах).

2. Биохимическая идентификация – изучение способности микроорганизмов ферментировать различные химические соединения.

Для изучения биохимической активности бактерий используют следующие реакции: ферментацию, окисление, ассимиляцию (утилизацию), диссимиляцию (деградацию) и гидролиз субстрата. Классический (традиционный) метод идентификации микроорганизмов по биохимическим свойствам заключается в посеве чистой культуры на дифференциально-диагностические среды, содержащие определенные субстраты, с целью оценки способности микроба ассимилировать данный субстрат или определения конечных продуктов его метаболизма. В бактериологической практике иногда ограничиваются изучением гликолитических (сахаролитических) и протеолитических признаков исследуемых бактерий, если этого достаточно для их идентификации. При необходимости изучают другие свойства: способность к восстановлению нитратов, карбоксилирование аминокислот, образование оксидазы, плазмокоагулазы, фибринолизина и др.

Биохимические тесты 2-го поколения, основанные на применении концентрированных субстратов и более чувствительных методов обнаружения конечных продуктов реакции, позволяют выявлять ферменты уже существующие в микробной клетке, и таким образом, не требуют дополнительного выращивания бактерий. Это позволяет существенно сократить сроки исследования (до 4 часов).

Биохимические тесты 3-го поколения основаны на применении субстратов, меченных хромогеном или флюорохромом. Такой комплекс не окрашен или не флюоресцирует. При разрушении меченного субстрата ферментом микроорганизма освобождается метка, что проявляется окрашиванием или флюоресценцией. Такие тесты позволяют использовать единичную бактериальную колонию, полученную при первичном посеве исследуемого материала на плотную питательную среду.

В лабораторной практике применяются готовые микротест-системы (МТС) для идентификации микроорганизмов. В современных МТС учет результатов и их интерпретация осуществляются автоматически с помощью компьютерных систем анализа.

Наряду с основными методами идентификации могут быть использованы:

1. Сероидентификация (изучение антигенного строения путем постановки различных серологических реакций).

2. Хемоидентификация (идентификация по химическому составу микробной клетки).

Хемоидентификация основана в первую очередь на анализе состава микробных липидов, осуществляемого с помощью метода хроматографии (метод газожидкостной хроматографии).

3. Фагоидентификация (чувствительность к видоспецифическим бактериофагам).

4. Способность к продукции определенных факторов вирулентности.

5. Видовая резистентность к определенным антимикробным препаратам.

6. Молекулярно-генетические методы идентификации, основанные на анализе бактериальных ДНК (рестрикционный анализ, гибридизация ДНК, полимеразная цепная реакция).