Мед энзимология

форма). Отравления фосфорорганическими веществами и инсектицидами сопровождаются выраженным снижением активности холинэстеразы.

Активность холинэстеразы наиболее резко снижается при тяжелых хронических заболеваниях печени, особенно при циррозе. Значительное снижение активности холинэстеразы наблюдается при распространенных бластоматозных поражениях печени. В начальных стадиях обтурационной желтухи снижение активности холинэстеразы встречается очень редко.

Ярким проявлением снижения белково-синтетической функции печени у больных вирусным гепатитом при развитии острой печеночной недостаточности является резкое снижение активности холинэстеразы; при этом степень снижения активности холинэстеразы обратно пропорциональна тяжести течения заболевания. Наиболее низкие показатели отмечаются у больных за несколько дней до развития печеночной комы. Однако длительный период полураспада сывороточной холинэстеразы (7–10 сут.) снижает ее ценность как диагностического теста при печеночной недостаточности.

При инфаркте миокарда резкое падение активности холинэстеразы отмечают к концу первых суток заболевания; оно обусловлено шоком, который приводит к тяжелому повреждению печени. В последнее время исследование этого фермента широко используется для контроля за применением релаксантов в хирургической практике. Курареподобные вещества (дитилин, сукцинилхолин), применяемые в хирургии для расслабления мышц, обычно быстро разрушаются, преимущественно холинэстеразой сыворотки. Тяжелые последствия применения этих средств (длительное апноэ, холинергический шок) возможны как при приобретенном недостатке холинэстеразы (чаще при хронических заболеваниях печени), так и при врожденном ферментном дефекте.

При нефротическом синдроме активность холинэстеразы повышается. Это связано с усилением синтеза альбуминов печенью из-за быстрой потери мелкодисперсной фракции белков с мочой. Повышение холинэстеразы наблюдается также иногда при ожирении и экссудативной энтеропатии.

Активность холинэстеразы незначительно возрастает при артериальной гипертонии, сахарном диабете, столбняке, хорее, маниакальнодепрессивном психозе, депрессивных неврозах, тревоге.

Показаниями к назначению анализа являются: диагностика возможного отравления фосфорорганическими инсектицидами; оценка функций печени при печеночной патологии (диагностика и мониторинг); выявление атипичных форм фермента для оценки риска осложнений при хирургических вмешательствах с применением миорелаксантов.

Повышение значений наблюдается при гиперлипопротеинемии IV типа, нефротической и смешанной формами гломерулонефрита (по-

51

теря белка с мочой), ожирении, в том числе при сахарном диабете, психозе, раке молочной железы.

Снижение значений наблюдается при печеночных патологиях: цирроз, гепатит, метастатический рак печени, застойная печень при сердечной недостаточности (низкая активность указывает на тяжелое течение болезни и является плохим прогностическим признаком), а также при острой или хронической интоксикациях фосфорорганическими инсектицидами (хлорофос, дихлофос), инфаркте миокарда, легочной эмболии, онкологических заболеваниях (раковая кахексия), на поздних сроках беременности и при синдроме мальабсорбции. Применение некоторых лекарственных препаратов (например, оральные контрацептивы, анаболические стероиды, глюкокортикоиды, циметидин, циклофосфамид и др.), мышечные дистрофии сопровождаются снижением активности фермента.

Эластаза

Эластаза-1 (панкреатическая) является протеолитическим ферментом, синтезируется в ацинарных клетках поджелудочной железы и экскретируется в просвет двенадцатиперстной кишки вместе с другими ферментами, в виде предшественника – проэластазы, которая активируется трипсином. Эластаза абсолютно специфична для поджелудочной железы и не детектируется ни в каких других органах или тканях. В сыворотке крови человека содержатся высокоактивные ингибиторы эластазы: альфа-1-антитрипсин и альфа-2-макроглобулин. Ингибиторы регулируют уровень активности эластазы в соответствии с физиологическими потребностями. В крови здоровых людей активность панкреатической эластазы 1 почти не определяется или очень низкая (Норма: 0,1– 4,0 нг/мл). Сывороточная эластаза, вследствие воспалительных процессов поджелудочной железы, попадает в общий кровоток через поврежденные клеточные мембраны. Подобно другим панкреатическим ферментам (амилаза, липаза) показатель эластазы панкреатической начинает увеличиваться в крови в острый период панкреатита, что позволяет поставить диагноз этого заболевания. Концентрация фермента начинает возрастать уже через 6 часов от начала заболевания, а через 48 часов достигает максимальных показателей, свидетельствующих о развитии острого панкреатита. Эластаза панкреатическая имеет более длительный период полураспада, чем амилаза и липаза, поэтому ее концентрация остается повышенной в течение нескольких дней (в основном 3–5 дней, в отдельных случаях до 10 дней). Этот тест назначается в комплексе с другими тестами для дифференциальной диагностики, либо подтверждения диагноза «острый панкреатит».

Эластаза (в кале). Человеческая панкреатическая эластаза-1 не разрушается при прохождении по кишечнику. Определение панкреатической

52

эластазы-1 в кале – новый неинвазивный тест для оценки экзокринной функции поджелудочной железы. Скрининг эндокринной панкреатической недостаточности показан, когда подозревают наличие хронического панкреатита или кистозного фиброза, а также при длительном мониторинге уже выявленной недостаточности поджелудочной железы при хроническом панкреатите. Ориентируясь на уровень эластазы 1 в кале, можно более точно назначать ферментные препараты и делать прогноз заболевания.

Для определения фермента кал собирают в течение 72 ч и анализируют в тот же день: при необходимости он может быть заморожен при –20 °С. На результаты определения панкреатической эластазы-1 в кале не влияет проведение заместительной терапии препаратами ферментов поджелудочной железы. Уровень эластазы-1 в стуле определяется иммуноферментным методом с использованием моноклональных

антител (Elastase 1 stool test®, ScheBo Biotech, Германия) и в норме со-

ставляет не менее 200 мкг/г кала. Более низкие показатели свидетельствуют о наличии экзокринной панкреатической недостаточности. Специфичность теста при исследовании кала составляет 94 %, чувствительность – 93 % – Stein J. et al., 1996]. Определение эластазы-1 в стуле показано во всех случаях, когда имеется подозрение на экзокринную недостаточность поджелудочной железы и обсуждается вопрос о применении препаратов панкреатических ферментов, так как использование этого метода позволяет избежать их необоснованного назначения. Снижение активности панкреатической эластазы-1 в кале выявляют у больных с хроническим панкреатитом, раком поджелудочной железы, сахарным диабетом типа 1 (менее 100 мкг/г у 3 % больных) и типа 2 (менее 100 мкг/г у 12 % больных), у детей с муковисцидозом, что отражает недостаточность экзокринной функции поджелудочной железы в данных группах пациентов.

53

ФЕРМЕНТЫ КАК АНАЛИТИЧЕСКИЕ РЕАГЕНТЫ В КЛИНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

До недавнего времени ферменты служили лишь объектом исследования в клинической биохимии, и лишь сравнительно недавно они стали использоваться, как аналитические реагенты, то есть как реактивы для количественного определения других веществ.

Преимущества ферментативных методов исследования: высокая точность, специфичность (в силу специфичности используемых ферментов), чувствительность. К этим «трем китам», на которых стоят ферментативные методы, следует добавить простоту проведения анализа, значительное сокращение времени исследования и, часто, отсутствие необходимости построения калибровочных графиков.

Использование ферментов как аналитических реагентов началось с так называемого оптического теста Варбурга. Этот тест основан на том, что восстановленные формы никотинамидадениндинуклеотидов (HAДH и HAДФН) имеют выраженный максимум поглощения в ультрафиолетовой области при 340нм, тогда как их окисленные формулы (HAД и HAДФ) этого максимума не имеют. Это позволяет следить за ходом ферментативной реакции по увеличению или уменьшению величины оптической плотностью при 340 нм, т.е. по увеличению или уменьшению содержания HAДH + Н+ (или НAДФH + H+) в анализируемом образце. Простейшим примером использования оптического теста Варбурга служит реакция, катализируемая ЛДГ:

Пируват + НАДН. Н+ ¾¾¾ЛДГ¾¾¾® Лактат + НАДН+

На рисунке представлено изменение оптической плотности в ходе реакции:

54

Поскольку в процессе окисления пирувата количество НAДH снижается, величина оптической пдлотности падает и это падение продолжается до тех пор, пока весь имеющийся в пробе пируват не вступит в реакцию. Этот момент соответствует выходу кривой на графике на плато. Так как пируват и НAДH вступают в реакцию в эквимолярных количествах, то убыль НAДH равна количеству пирувата, содержащегося в анализируемом образце. Расчет содержания пирувата может быть произведен на основании коэффициента молярной экстинкции НАДН + H+, равного 6,22·102 м2 /М по формуле

	C = DE ×	V1	×	1		,	(1)
				ε ×	d
		V
		2

где С – концентрация пирувата в мМ; ε – коэффициент молярной экстинкции; V1 – объем реакционной смеси; V2 – объем исследуемого образца; d – длина светового пути; ΔЕ – изменение величины оптической плотности.

Аналогичным образом может проводиться количественное определение всех веществ, являющихся субстратами дегидрогеназ (малат, лактат, сукцинат и т.д.). Построение калибровочных графиков или использование калибраторов здесь не требуется, т.к. расчет ведется по коэффициенту молярной экстинкции. Однако следует заметить, что величина этого коэффициента зависит от состава реакционной среды и в некоторых случаях мо-

жет незначительно отклоняться от величины 6,22 · 102. Рассмотренная выше ЛДГ-реакция служит в качестве индикаторной при определении активности АлАТ. В этой сопряженной системе реакции протекают по схеме

α -аланин + α -кетоглутарат ¾¾¾АлАТ¾¾¾® пируват + α -глутамат пируват + НАДН. Н+ ¾¾¾¾¾¾®ЛДГ лактат + НАД+

Реакция сопровождается снижением величины оптической плотности при 340 нм, скорость которого пропорциональна активности АлАТ. Аналогичным образом может быть определена активность АсАТ. Но индикаторным ферментом в этом случае будет малатдегидрогеназа. Расчет активности ферментов, определение которых проводится с помощью оптического теста Варбурга, также может быть проведен на основании коэффициента молярной экстинкции по формуле

	E	×	1		× 103	=	мкМ		,
	Dt		ε ×	d			мин ×	л
	где ΔЕ – изменение оптической плотности;						t – время измерения (мин); ε –

коэффициент молярной экстинкции (6,22 · 102 м2/М); d – длина светового пути, см; V1 – объем реакционной смеси; V2 – объем анализируемого образца.

55

На использовании в качестве индикаторного фермента глюкозо-6- фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) основан самый точный метод из всех существующих методов определения глюкозы. Здесь реакция идет по схеме:

Глюкоза + АТФ ¾¾¾гексокиназа¾¾¾¾¾¾¾® глюкозо-6-фосфат + АТФ Глюкозо-6-фосфат + НАДФ+ ¾¾¾Г¾¾¾¾®6ФДГ 6-фосфоглюконат + НАДФН. Н+

Глюкоза при участии гексокиназы фосфорилируется в глюкозо-6- фосфат, который с помощью глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы окисляется в 6-фосфоглюконовую кислоту. Эта реакция сопровождается накоплением НАДФН и, следовательно, возрастанием оптической плотности при 340 нм. Расчет содержания глюкозы в анализируемом образце может быть произведен по формуле (1).

Другой подход к определению глюкозы основан на использовании сопряженной системы глюкозооксидаза + пероксидаза и более широко известен. При участии глюкозооксидазы глюкоза окисляется кислородом воздуха с образованием перекиси водорода, количество которой определяется по ее способности в присутствии пероксидазы окислять диамины с образованием окрашенных продуктов:

Глюкоза + О2 + H2O ¾¾¾глюкозооксидаза¾¾¾¾¾¾¾¾¾® глюконовая кислота + H2O2 H2O2 + краситель ¾¾¾¾¾пероксидаза¾¾¾¾¾® окрашенный продукт + H2O

В качестве красителей (индикаторов) для пероксидазной реакции предложена целая группа веществ: о-толидин, о-дианизидин, фенол+ 4- амино-антипирин и др.

Считают, что реакция с 4-амино-антипирином более предпочтительна, т.к. развивающаяся окраска более стабильна, чем при использовании других веществ.

Эта же пероксидазная реакция с участием 4-амино-антипирина, предложенная Триндером, может быть использована для количественного определения холестерина и триглицеридов.

При определении холестерина его эфиры гидролизуются холестеролэстеразой до свободных жирных кислот и холестерина, который под воз-

действием холестеролоксидазы окисляется кислородом воздуха до D4- холестерола. Образующаяся при этом перекись водорода в присутствии пероксидазы окисляет вещества-индикаторы с образованием окрашенных соединений, интенсивность окраски которых пропорциональна содержанию холестерина в исследуемом образце:

56

Эфиры холестерина ¾¾¾холестеролэстераза¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾® холестерин + R-COOH

Холестерин + O2 ¾¾¾холестеролоксидазы¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾® D4 -холестенон + H2O2

2H2O2 + 4-аминоантипирин + фенол ¾¾¾пероксидаза¾¾¾¾¾¾¾® окрашенный продукт + 4H2O2

Описанный метод определения холестерина является самым точным из ныне существующих. В реакции Либермана–Бурхарда, рутинном методе определения холестерина участвуют и другие стерины, что приводит к завышенным результатам. К другим преимуществам ферментативного метода следует отнести отсутствие влияния примесей билирубина и гемоглобина, необходимости проводить длительный гидролиз эфиров и экстракцию холестерина, отсутствие агрессивных реагентов.

Еще более сложная ферментная система может быть использована для определения триглицеридов. Триглицериды расщепляются липазой до жирных кислот и глицерина, который при участии глицерокиназы и АТФ фосфорилируется с образованием глицерол-3-фосфата. Глицерол-3-фосфат в присутствии глицерофосфатоксидазы окисляется кислородом воздуха с образованием фосфодиоксиацетона и перекиси кислорода, которая в свою очередь окисляет краситель с образованием окрашенного комплекса, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации триглицеридов в исследуемом образце.

Триглицерид + 3H2O ¾¾¾липаза¾¾¾¾® глицерин + 3R-COOH Глицерин + АТФ ¾¾¾¾¾глицерокиназа¾¾¾¾¾¾® глицерол-3фосфат + АТФ

Глицерол-3фосфат + O2 ¾¾¾¾¾глицеролфосфат¾¾¾¾¾¾¾® фосфодиоксиацетон + H2O2

оксидаза

H2O2 + 4-аминоантипирин + 4-хлорфенол ¾¾¾пероксидаза¾¾¾¾¾¾¾®

¾¾¾¾¾пероксидаза¾¾¾¾¾® окрашенный комплекс + 2H2O + HCl

Этот метод определения триглицеридов наиболее специфичен, исключительно точен и чрезвычайно прост в исполнении.

В настоящее время разработана целая группа ферментативных методов определения мочевой кислоты. Первым этапом этих методов является расщепление мочевой кислоты уриказой до аллантоина, углекислоты и пероксида водорода:

Мочевая кислота + 2H2O + O2 ¾¾¾уриказа¾¾¾¾® аллантоин + CO2 + H 2 O2

Образовавшийся пероксид водорода может быть определен разными способами:

−по реакции с 4-аминоантипирином или другим аналогичным красителем;

−превращением метанола с участием каталазы в формальдегид, который определяется специальными методами;

57

− окислением перекисью этанола в ацетатальдегид, который затем восстанавливается НАДH (оптический тест Варбурга).

Следует отметить высокую специфичность всех ферментативных методов определения мочевой кислоты по сравнению с рутинными фосфорновольфрамовыми методами т.к. кроме мочевой кислоты фосфорновольфрамовую кислоту восстанавливает аскорбиновая кислота, тирозин, триптофан, цистин, цистеин и др.

Еще большее количество методов предложено для ферментативного определения мочевины. Первым этапом всех этих методов является расщепление мочевины уреазой до аммиака и углекислоты:

Мочевина + H2O ¾¾¾уреаза¾¾¾¾® 2NH+4 + CO2

Определение ионов аммония может быть осуществлено разными способами:

−классической Бертолетовой реакцией;

−модифицированной Бертолетовой реакцией с салицилатом натрия;

−с помощью оптического теста Варбурга.

Впоследнем случае в качестве индикаторной служит реакция

NH+ + α -кетоглутарат + НАДН ¾¾¾¾¾¾¾глутаматдегидрогеназа¾¾¾¾¾¾¾¾¾® глутамат + НАД+ 2H2O

Все эти методы высокоспецифичны, т. к. для уреазы мочевина является единственным физиологическим субстратом, но наиболее точным является метод с оптическим тестом Варбурга.

В настоящее время разрабатывается новое направление в использовании ферментов: ферментативных методах определения электролитов (К+, Nа+, Сl+). Эти методы основаны на способности электролитов оказывать активирующее влияние на активность некоторых ферментов.

58

НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ЭНЗИМОТЕРАПИИ

Для практического здравоохранения особый интерес представляет использование очищенных препаратов ферментов, коферментов и регулирующих их активность ингибиторов и активаторов в качестве терапевтических средств. Среди ферментов для клиники наибольшее значение имеют гидролитические, особенно белокрасщепляющие – протеолитические энзимы. Последние, составляя систему протеолиза, играют ключевую роль в важнейших биологических процессах: обмене белков, защитных реакциях организма (свертывание крови, фибринолиз), иммунологических реакциях, регуляции сосудистого тонуса, дифференциации, метаболизме соединительной ткани и др. Эти функции протеолитических ферментов реализуются с помощью ограниченного протеолиза без энергетических затрат, характерной чертой которого являются быстрота и высокая экономичность.

Так, для лечения ряда болезней пищеварительного тракта применяют некоторые протеиназы: пепсин, трипсин, химотрипсин и их смеси (абомин, химопсин). Помимо протеиназ, ряд других ферментов, в частности РНКаза, ДНКаза, гиалуронидаза, коллагеназы, эластазы, отдельно или в смеси с протеиназами используются при ожогах, для обработки ран, воспалительных очагов, устранения отеков, гематом, келоидных рубцов, кавернозных процессов при туберкулезе легких и др. Ферменты применяются также для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, растворения сгустков крови. В нашей стране разработан первый в мире препарат иммобилизованной стрептокиназы, рекомендованный для лечения инфаркта миокарда. Калликреины – ферменты кининовой системы используются для снижения кровяного давления.

Важной и многообещающей областью энзимотерапии является применение ингибиторов ферментов. Так, естественные ингибиторы протеиназ (α1-трипсин, α1-химотрипсин, α-макроглобулин) нашли применение в терапии острых панкреатитов, артритов, аллергических заболеваний, при которых отмечается активация протеолиза и фибринолиза, сопровождающаяся образованием вазоактивных кининов.

В последнее время получило признание применение в онкологической клинике ферментов бактериальной природы в качестве лекарственных средств. Широко используется L-аспарагиназа (выпускается в промышленных количествах и L-глутамин(аспарагин)аза для лечения острых и хронических форм лейкозов и лимфогранулематозов. Более десятка описанных в литературе бактериальных ферментов испытаны в основном на животных с перевивными опухолями или на раковых клетках опухолей человека и животных, выращенных в культуре ткани. Основными постулатами применения ферментов в онкологии являются различия в метаболизме клеток опухолей по сравнению с обменом в нормальной, здоровой, клетке. В частности, современные стратегия и тактика энзимотерапии опухолевых поражений учитывают разную чувствительность нормальных и опухолевых клеток к недостатку (дефициту) не-

59

заменимых (так называемых эссенциальных) факторов роста. К таким ростстимулирующим факторам относятся не только пищевые факторы (витамины, незаменимые аминокислоты, макро- и микроэлементы), но и ряд так называемых заменимых веществ, включая заменимые аминокислоты, к недостатку которых опухолевая клетка оказывается в силу особенностей ее обмена более чувствительной, чем нормальная. Лечебный эффект, например, L-аспарагиназы и L-глутамин(аспарагин)азы при лейкозах, вероятнее всего, объясняется необратимым распадом как глутамина, так и аспарагина. Оказалось, что опухолевые клетки для своего роста и размножения нуждаются в аминокислотах из организма, поскольку сами лишены способности синтезировать амиды аминокислот, в то время как нормальные клетки наделены этой способностью. Был сделан вывод о том, что амидный азот глутамина и аспарагина выполняет в клетках ряд уникальных функций, которые лучше выяснены для глутамина. В частности, амидный азот глутамина оказался абсолютно необходимым и незаменимым другими аминокислотами источником атома азота минимум в 10 реакциях синтеза, например, пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, соответственно ДНК и РНК, АТФ, гексозаминов, гистидина и др. Таким образом, не лишена основания гипотеза, что любой фермент или агент, катализирующий необратимое расщепление незаменимого для опухолевой клетки пищевого фактора (включая аминокислоты), может в принципе быть применен в энзимотерапии опухолей, если будут устранены ограничения, связанные с белковой природой фермента. В оценке эффективности ферментов в экспериментальной и клинической онкологии имеется немало противоречий и очень много пробелов. Положительные результаты, отмеченные в ряде случаев, вселяют надежду, что приготовление стандартных ферментных препаратов (включая создание иммобилизованных форм) в промышленных масштабах и их разумное применение в клинике, организованное на строгой научной основе, несомненно, дадут в руки врачей еще одно ценное оружие в борьбе с опухолевыми заболеваниями человека.

В настоящее время активно разрабатывается системная энзимотерапия (СЭТ) – это лечение с помощью целенаправленно составленных смесей гидролитических энзимов, лечебная эффективность которых основана на комплексном воздействии на ключевые процессы, происходящие в организме.

Препаратами системной энзимотерапии являются, напрмер, вобэнзим, флогэнзим и вобэ-мугос Е (MUCOS Pharma GmbH & Co., Германия), представляющие собой комбинацию натуральных высокоактивных энзимов растительного и животного происхождения.

Клинические испытания показали, что вобэнзим, флогэнзим и вобэмугос Е удовлетворяют всеобщему терапевтическому принципу: надежность и высокая эффективность при общей хорошей переносимости, что и определяет широкий спектр их клинического использования. Действуя системно, энзимы оказывают разнообразные эффекты, реализуя свое влияние через противовоспалительное, иммуномодулирующее, антиагрегатное,

60