Информация к занятию

Обмен веществ у бактерий и эукариотов сходен, представляя собой совокупность двух противоположных, но взаимосвязанных процессов – катаболизма (энергетический метаболизм, дыхание, диссимиляция) и анаболизма ( пластический или конструктивный метаболизм, питание, ассимиляция). Питательные вещества - пластический материал и источник энергии поступают в бактерию из внешней среды пассивно через отверстия в оболочке. По типам питания бактерии делят на аутотрофы (не требуют органических веществ, используя для построения сложных органических веществ углекислоту, азот воздуха, воду) и гетеротрофы (нуждаются в органических соединениях).

Для культивирования бактерий в лабораторных условиях применяют искусственные питательные среды различного состава (рис. 24, см. приложение). Питательные среды используются для получения и сохранения чистых культур микроорганизмов, изучения особенностей их морфологических, биохимических и других свойств.

В микробиологической практике для культивирования многих видов бактерий широко применяются простые питательные среды, являющиеся также основой для приготовления ряда сложных питательных сред: сахарных, сывороточных, кровяных и др.

По составу среды подразделяют на естественные (животного или растительного происхождения - молоко, яйца, овощи, животные ткани, желчь, сыворотка крови и др.), искусственные (настои, отвары животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ), а также синтетические (необходимые для конкретного вида микробов точные дозы определенных химических веществ).

По консистенции выделяют жидкие (для накопления и изучения биологических свойств микроорганизмов), полужидкие (для хранения культур), плотные (для выделения микроорганизмов, изучения морфологии колоний, диагностических целей, количественного учета, определения антагонистических свойств и др.), сыпучие (для хранения посевного материала, культур-продуцентов в микробиологической и медицинской промышленности - разваренное пшено, кварцевый песок, пропитанный питательным раствором и др.) и сухие питательные среды. Разнообразные сухие питательные среды, выпускаемые промышленностью (рис.25), отличаются стандартностью, простотой хранения, транспортировки и приготовления. Для получения плотных питательных сред обычно используют агар (полисахарид морских водорослей, способный образовывать гель).

По назначению среды подразделяют на простые, специальные, элективные, дифференциально-диагностические. Простые среды (мясо-пептонный бульон - МПБ, мясопептонный агар МПА, сусло жидкое, сусло-агар) используют для культивирования многих микроорганизмов.

Специальные среды (например, МПБ с глюкозой для культивирования стрептококков и др.) применяют для выделения и культивирования определенных видов микроорганизмов.

Элективные среды (например, пептонная вода) используют для выделения некоторых видов микроорганизмов (например, холерного вибриона). Сопутствующая микрофлора на таких средах либо вовсе не растет, либо рост ее значительно угнетается.

Дифференциально-диагностические среды применяют для изучения биохимических свойств и отличия (дифференцировки) одного вида микроорганизмов от другого по характеру их ферментативной активности. Так, для выделения ряда патогенных кишечных бактерий применяют среды, которые позволяют дифференцировать патогенные микроорганизмы, неспособные ферментировать лактозу, от постоянных обитателей кишечника — микроорганизмов, разлагающих лактозу. Такими средами являются среды Эндо и Левина, в состав которых входит лактоза. Основными компонентами среды Эндо являются МПА, лактоза и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия. В состав среды Левина входит МПА, лактоза, красители эозин и метиленовый синий. При сбраживании лактозы образуется ацетальдегид, который реагирует с компонентами питательных сред, окрашивая колонии в красный цвет. Поэтому кишечная палочка, сбраживающая лактозу, при росте на этих средах образует красные колонии с металлическим блеском, а сальмонеллы и шигеллы — бесцветные, так как они лактозу не разлагают (рис. 25).

Любая питательная среда должна содержать необходимые для роста и размножения микроорганизмов вещества, должна иметь достаточную влажность, соответствующую реакцию среды (рН), быть стерильной, прозрачной, изотоничной, обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом.

Все питательные среды разливают в чистую посуду и стерилизуют. Большинство сред стерилизуют автоклавированием.

Для контроля стерильности среды после стерилизации помещают в термостат при 37⁰ С на 5 суток. Жидкие среды должны оставаться прозрачными, а на поверхности и в толще плотных питательных сред не должны появляться признаки роста. Химический контроль готовых сред предполагает определение рН, количества общего и аминного азота, хлоридов в нескольких образцах каждой серии. Биологический контроль сред заключается в посеве индикаторной лабораторной культуры микроорганизмов в несколько образцов данной среды с последующим изучением характера ее роста.

В своей практической работе фармацевт должен знать принципы асептики и антисептики, методы стерилизации и дезинфекции.

Асептика– система мероприятий, исключающая попадание микробов из внешней среды в организм человека при лечебных и диагностических процедурах, а также в материал для исследования, питательные среды и культуры микроорганизмов при выполнении микробиологических исследований. Асептика основывается на стерилизации инструментов и материалов, обработке рук медицинских работников, соблюдении санитарно-гигиенических правил и приемов работы.

Антисептика- комплекс лечебно-профилактических мероприятий, целью которых является уничтожение микроорганизмов, способных вызвать инфекционный процесс на поврежденных или неповрежденных участках кожи и слизистых оболочек. В качестве антисептических средств используются следующие антимикробные препараты: 70% этиловый спирт, 5% раствор йода,0,5-2,0% раствор хлорамина, 0,1% раствор перманганата калия, 0,5-1,0% раствор формалина, 1-2% растворы метиленевого синего или бриллиантового зеленого и т.д.

Дезинфекция– обеззараживание объектов внешней среды с уничтожением патогенных для человека и животных микроорганизмов с помощью химических антимикробных веществ.К дезинфицирующим препаратам относятся разнообразные по своей химической природе антисептические вещества: фенолы и их производные, тяжелые металлы, некоторые кислоты, спирты и др. В лабораторной практике в качестве дезинфицирующих средств используются растворы карболовой кислоты или фенола (3-5%), лизола (4%), хлорной извести (10-20%), хлорамина (1-3%), 3-6% перекиси водородаи др.

Изделия медицинского назначения, используемые при проведении гнойных операций или оперативных манипуляций у инфекционного больного (табл. 1), перед предстерилизационной обработкой и стерилизацией подвергают дезинфекции, не вынося из отделения, одним из вышеуказанных режимов.

При дезинфекции изделий медицинского назначения дезинфицирующими растворами проводят предварительное ополаскивание в таком же дезинфицирующем растворе, но в другой ёмкости, т. к. при контакте с кровью и другими белковыми веществами активность раствора падает.

Изделия из коррозионно-нестойких металлов обеззараживают преимущественно кипячением. Перед кипячением изделия, загрязнённые кровью, промывают водой. Смывные воды обеззараживают.

Стерилизация (обеспложивание) - это полное уничтожение вегетативных форм микроорганизмов и их спор в различных материалах. Методы стерилизации и применяемая для этого аппаратура отражены в таблице 2.

Контроль работы автоклава осуществляется физическими, химическими и биологическими методами. Температуру пара измеряют максимальным термометром, который помещают в автоклав вместе со стерилизуемым материалом. Используются также химические вещества с определенной температурой плавления (бензонафтол – 110⁰ С, бензойная кислота – 120⁰ С и др.), в смеси с красителем (фуксин, сафранин), помещаемые в стеклянные трубочки, которые затем ставят в автоклав. После плавления эти вещества равномерно окрашиваются красителями. Для бактериологического контроля стерилизации берут полоски фильтровальной бумаги, смоченные тест-культурой споровых бактерий. Эти тесты после автоклавирования засевают на питательные среды и по отсутствию роста бацилл судят об эффективности стерилизации.

Таблица 1. Дезинфекция предметов медицинского назначения

Инфекции
Гнойные заболевания, кишечные и капельные инфекции бактери­альной этиологии.	Туберкулез	Вирусные гепатиты
1.Кипячение в дистиллированной воде - 30 мин	1.Кипячение в дистиллиро­ванной воде - 30 мин	1.Кипячение в дистиллиро­ванной воде - 30 мин.
2. Кипячение с гидрокарбонатом натрия 2% -15 мин	2.Кипячение с гидрокарбона­том натрия 2 % -15 мин	2.Кипячение с гидрокарбона­том натрия 2% -15 мин.
3. Хлорамин 1% - 30 мин.	3. Хлорамин 5% - 240 мин.	3.Хлорамин 3% - 60 мин.
4.Перекись водорода 3% - (с 0,5% моющего средства)-80 мин.	4. Перекись водорода 4% (с 0,5% моющего средства) - 180 мин.	4.Перекись водорода 4% (с 0,5% моющего средства) - 90 мин.
5.Паровой метод. Водяной насыщенный пар 0,5 кгс (кв см)-110^0С-20мин.		5.Перекись водорода 6%- 60 мин.

Таблица 2. Методы стерилизации и применяемая для этого аппаратура

Метод	Прибор	Режим	Объекты
Прокаливание (простой, полный)	Газовая или спиртовая горелка	Не менее 200^оС, секунды или минуты	Бактериологические петли, иглы, предметные стекла, инструменты
Кипячение (простой, неполный)	Стерилизатор	100^оС, минуты, часы	Инструменты. Промежуточный этап обработки зараженных пипеток, шпателей, стекол
Стерилизация паром под давлением (полный, сложный)	Автоклав	1. Режим:- 2,0 атм-132^0С - 20 минут 2. Режим:- 0,7 атм. 110^0С, 45 минут	Питательные среды (МПА, МПБ, ПВ). Зараженный материал в посуде, баках, трупы животных Питательные среды с углеводами и молоком, разлитые в стерильную посуду
Стерилизация паром, дробная (полный, сложный)	Автоклав с незакрытой крышкой	100^оС, 3 дня по 30 минут	Желатин, иногда среды с углеводами или молоком
Тиндализация (полный, простой)	Водяная баня, кастрюля, бак	56^оС, 5-6 дней по 1 часу	Сыворотки
Стерилизация сухим жаром (полный, сложный)	Сухожаровой шкаф (печь Пастера)	180^0С, 60 минут	Лабораторная посуда (пипетки, пробирки, колбы, чашки, шпатели) без сред и резиновых пробок
Пастеризация (в бактериологической практике не применяется	Специальные установки, кастрюля, бак	60^оС- 70^оС, 20-30 минут	Пищевая промышленность (молоко, пиво, вино и т.д.), детское молочное питание на молочных кухнях
Фильтрование (сложный, полный, если нет вируса)	Бактериальные фильтры, свечи из фарфора, каолина, асбестовые пластины, нитроцеллюлозные мембраны, миллипоровые фильтры	При создании вакуума в полости свечи или в приемнике на установке Зейтца, минуты, часы	Лекарства, не переносящие высокой температуры. Выделение вирусов.
Ультрафиолетовые лучи (полный, сложный)	Бактерицидные лампы	Минуты и часы	Боксы, помещения вирусологических и иммунологических лабораторий, операционные, перевязочные, процедурные
Ультразвук	Специальный ультразвуковой генератор	Минуты, часы	Пищевая промышленность, получение препаратов из бактерий, стерилизация воды
Радиация	Специальные установки	Минуты, часы	Предметы медицинского назначения

Методы выделения чистых культур микроорганизмов

Чистая культура микроорганизма представляет собой популяцию клеток одного вида. Культура растет в виде отдельных колоний на плотной питательной среде.

Методы выделения чистых культур аэробных микроорганизмов подразделяются на 2 группы:

а) методы, основанные на принципе механического разобщения микроорганизмов:

• посев по методу Дригальского осуществляется шпателем последовательно на 3 чашки с МПА. В зависимости от содержания микробных клеток в исследуемом материале, на одной из чашек вырастают отдельные колонии, используемые для выделения чистой культуры микроорганизма;

• рассев петлей (посев штрихами). Исследуемый материал петлей засевают последовательно на 4 сектора МПА в чашке Петри, проводя петлей параллельные линии на расстоянии 5 мм одна от другой. На секторах с небольшим количеством клеток вырастают отдельные колонии, описываемые согласно таблице.

б) методы, основанные на биологических свойствах микроорганизмов:

• метод фильтрации основан на разделении микроорганизмов по величине путем пропускания исследуемого материала через специальные (миллипоровые) фильтры с определенным диаметром пор

• Методы, основанные на «ползучих» свойствах микроорганизмов, например, метод Шукевича для выделения чистой культуры протея. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного МПА, из которой протей как бы «вползает» на его поверхность.

• Метод прогревания, позволяющий отделить спорообразующие бациллы от неспоровых форм. Для этого исследуемый материал прогревают на водяной бане при 80⁰ С 10-15 мин., при этом вегетативные формы погибают, а споры сохраняются и прорастают.

• Бактериостатический метод (метод ингибирования роста бактерий определенными химическими веществами или антибиотиками). Например, небольшие концентрации пенициллина задерживают рост грамположительных микроорганизмов, но не влияют на грамотрицательные. Смесь пенициллина и стрептомицина позволяет освободить грибы от бактериальной флоры, а нистатин ингибирует грибы, но не влияет на бактерии.

• Метод обогащения - посев исследуемого материала засевают на элективные питательные среды, предназначенные для выделения определенного вида микроорганизмов.

• Метод заражения чувствительных видов лабораторных животных или растений для выделения облигатных патогенных микроорганизмов. После появления у зараженных животных признаков болезни их умерщвляют и производят посев органов и тканей на питательные среды с целью выделения чистой культуры микроорганизмов.

Выделение чистых культур бактерий включает 3 этапа

1. посев исследуемого материала с целью получения изолированных колоний;

2. пересев колоний с целью накопления чистой культуры;

3. проверка чистоты выделенной культуры микробов и ее идентификация по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, антигенным свойствам, отношению к бактериофагу.

Выделение чистых культур бактерий обычно занимает 2-3 дня, медленно растущих (микобактерии туберкулеза) – 4-6 недель и более.