2. Выделение чистой культуры анаэробных бактерий из почвы (демонстрация):

• изучение характера роста на среде Китт-Тароцци;

• изучение морфологических и тинкториальных свойств микроор­ганизмов, выросших на среде Китт-Тароцци; приготовление мазка, окраска его по Граму, микроскопия. Обратить внимание на наличие в микропрепарате крупных, расположенных беспорядочно или короткими цепочками, грамположительных палочек; выполнить посев одной петли материала со среды Китт-Тароцци в высокий столбик МПА, расплавленного на водяной бане и остуженного до 45° С. Результаты исследования занести в протокол.

3.Выделение чистой культуры протея по методу Шукевича(самостоятель­ная работа). Произвести посев исследуемого материала петлей в конденсацион­ную воду скошенного МПА. Ход исследования отразить в протоколе.

Тема 6.Физиология бактерий. Ферменты бактерий. Выделение чистых культур аэробных и анаэробных бактерий Перечень конкретных учебно-целевых вопросов

1. Ферменты бактерий и их классификация Значение изучения ферментативной активности бактерий для определения их видовой принадлежности.

2. Практическое использование бактериальных ферментов.

3. Белковый, углеводный, липидный и минеральный обмены у бактерий.

4. Пигментообразование у бактерий. Значение пигментов в жизне­деятельности бактерий и для идентификации микроорганизмов.

5. Характеристика L-форм бактерий.

Информация к занятию Ферменты бактерий и методы их определения

Ферменты микроорганизмов являются белками - катализаторами химических реакций, происхо­дящих в организме. В микробиологической практике определение ферментов используют для идентификации микроорганизмов, т.к. каждый микробный вид характеризуется определенной биохимической активностью.

Для определения протеолитической активности микроорганизмы засевают в столбик желатина уколом, наблюдая через 3—5 дней разжижение желатина. При разложении белка некоторыми бактериями могут выделяться индол, сероводород, аммиак. Для их определения служат специальные индикаторные бумажки, которые помещают между горлышком и ватной пробкой в пробирку с МПБ или (и) пептонной водой, засеянными изучаемыми микроорганизмами. Индол (продукт разложения триптофана) окрашивает в розовый цвет полоску бумаги, пропитанной насыщенным раствором щавелевой кислоты. В присутствии сероводорода полоска бумаги, пропитанная раствором ацетата свинца, чернеет. Для определения аммиака используют лакмусовую бумажку.

Важным признаком многих микроорганизмов является способность разлагать определенные углеводы с образованием кислот и газообразных продуктов. Для выявления этого свойства бактерий используют среды Гисса, содержащие различные углеводы (глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу и др.) и индикаторы (например, реактив Андреде, меняющий свой цвет от бледно-желтого до красного в интервале рН 7,2—6,5), поэтому эти среды нередко называют «пестрым» или «цветным» рядом. Для обнаружения газообразования в жидкие среды опускают стеклянные поплавки или используют полужидкие среды. Сбраживание лактозы в молочных средах определяют по их свертыванию или изменению цвета лакмусового индикатора, а также при пептонизации.

При идентификации многих микроорганизмов используют реакцию Фогеса — Проскауэра на ацетоин (промежуточное соединение при образовании бутандиола из пировиноградной кислоты). Для этого к 3 мл культуры микроорганизмов на среде Кларка добавляют 1 мл свежеприготовленного 10% спиртового раствора α-нафтола и 1 мл 20% водного раствора гидроксида калия. При наличии ацетоина СНзСНОН СОСН₃ жидкость приобретает красную окраску, что свидетельствует о бутандиоловом брожении.

Каталаза - фермент, катализирующий реакцию разложения перекиси водорода с образованием воды и кислорода, содержат аэробы и факультативные анаэробы, но не анаэробы. Для обнаружения фермента небольшое количество исследуемой культуры эмульгируют в капле перекиси водорода, наблюдая выделение пузырьков кислорода.

Определение цитохромоксидазы (фермента, обеспечивающего перенос электронов на атом кислорода в процессе анаэробного дыхания) проводят при дифференциации энтеробактерий, применяя смесь 1% спиртового раствора β–нафтола и 1% водного раствора N-диметил-парафенилендиамина дигидрохлорида, смешанных в соотношении 2:3. На полоску фильтровальной бумаги, смоченной этим реактивом, наносят петлей культуру микроорганизмов. При наличии фермента через 2-5 мин полоска окрашивается в синий цвет.

Важным биохимическим свойством у ряда микробов является их способность восстанавливать нитраты в нитриты. Для определения нитритов используют реактив Грисса, который готовят из 2 растворов: (первый - 0,5 г сульфаниловой кислоты, растворенной в 30 мл ледяной уксусной кислоты, с последующим добавлением 100 мл воды; второй - 0,1 г нафтиламина, растворенного в 100 мл кипящей воды, с последующим добавлением 30 мл ледяной уксусной кислоты). Оба раствора смешивают в равных объемах, 0,1 мл реактива добавляют в культуру бактерий. Окрашивание культуры в красный цвет указывает на присутствие нитритов.

Гидролиз мочевины определяют по выделению аммиака (лакмусовая бумажка) и изменению реакции среды в щелочную сторону (с pH 7,2 до 8,8, при этом среда приобретает пурпурно-красный цвет).