- •Глава 1.
- •1.1. Тенденции и проблемы вэжх
- •1.2. Физико-химические критерии совместимости компонентов системы
- •1.3. Хроматографические свойства сорбатов
- •1.3.1. Полярность и гидрофобность
- •1.3.2. Строение сорбата и растворимость
- •1.3.3. Оптические свойства
- •1.3.4. Рефракционные свойства
- •1.4 Сорбенты для вэжх
- •1.4.1 Сорбенты для нормально-фазовой хроматографии
- •1.4.2. Привитые сорбенты для нормально-фазовой хроматографии
- •1.4.3. Сорбенты для обращенно-фазовой хроматографии
- •1.4.4. Сорбенты для эксклюзионной хроматографии
- •1.4.5. Количественная оценка полярных свойств сорбентов
- •1.5. Хроматографические свойства индивидуальных растворителей
- •1.5.1. Оптические свойства
- •1.5.2. Полярность и элюирующая сила
- •1.5.3. Смешиваемость. Миксотропный ряд
- •1.5.4. Обобщенные критерии полярности растворителей
- •1.5.5. Обобщенные критерии элюирующей силы растворителей
- •Глава 2
- •2.1. Плотность и объемные свойства
- •2.2. Вязкость
- •2.3. Показатель преломления
- •2.4. Оптические свойства
- •2.5. Элюирующая сила
- •2.5.1. Элюирующая сила в нормально-фазовой хроматографии
- •2.5.2. Элюирующая сила в обращенно-фазовой хроматографии
- •Глава 3. Изобары температуры кипения бинарных
- •3.1. Азеотропные составы бинарных растворителей, перспективы применения в вэжх
- •3.2. Инвариантное описание изобар температур кипения бинарных
- •Глава 4. Общие закономерности удерживания сорбатов
- •4.1. Нормально-фазовая система сорбат – элюент – сорбент
- •4.2. Нормально-фазовая хроматография гидрофобных сорбатов
- •4.3. Разделение и идентификация таутомерных форм гидрофобных
- •4.4. Обращенно-фазовая система сорбат – элюент – сорбент
- •4.5. Обращенно-фазовая хроматография некоторых гликозидов
- •Глава 5. Хемометрические приемы оптимизации методик вэжх
- •5.1. Принципы построения поисково-аналитических систем для вэжх
- •5.3. Оценка оптимальности состава бинарной подвижной фазы
- •Список литературы
- •394006 Воронеж, ул. 20-летия Октября,84
4.3. Разделение и идентификация таутомерных форм гидрофобных
β-кетоэфиров в условиях нормально-фазовой хроматографии
При изучении ВЭЖХ желтых ЦФК был установлен любопытный факт ‒ один из полупродуктов желтых ЦФК ‒ о-октадецилоксибензоилметилацетат (ОБА) в определенных условиях НФХ демонстрировал раздвоение хроматографических пиков чистого образца, аналогичное явление наблюдали и для некоторых β-кетоанилидов, полученных из данного β-кетоэфира. Оно было интерпретировано как разделение кето- и енольной форм этого соединения [48].
Если кето-енольное равновесие устанавливается достаточно медленно, возможно хроматографическое разделение кето- и енольной форм, так как они различаются по полярности. Так, для енольной формы logР=8.08, а для кетоформы logР=7.88. Рассмотрим хроматографическое поведение ОБА в различных вариантах ВЭЖХ, и определим признаки хроматографического разделения таутомерных форм. Для этих целей используем следующие приемы: 1) препаративное выделение предполагаемых таутомеров и повторное хроматографирование собранных фракций; 2) изменение аналитической длины волны; 3) снятие УФ-спектров веществ, соответствующих отдельным хроматографическим пикам, в остановленном потоке ПФ; 4) изменение полярности ПФ, замена режима НФХ на ОФХ; 5) добавление в ПФ реагентов, катализирующих кето-енольные превращения.
Наглядным подтверждением хроматографического разделения таутомеров стали результаты препаративной ВЭЖХ. В режиме хроматографирования с нормальными фазами первым из колонки вымывается менее полярный енол, вторым – более полярный кетотаутомер. Найдено, что соотношение площадей пиков енольной и кетоформы Sе/Sк при повторном хроматографировании полученных фракций остается таким же, как на хроматограмме исходного образца, если оно проведено по истечении времени, достаточного для установления кето-енольного равновесия (рис. 67). В случае смеси индивидуальных веществ соотношение пиков должно изменяться после препаративного разделения необратимо.
|
Рис. 67. Хроматограммы, полученные при препаративном разделении таутомеров ОБА (1) и повторном хроматографировании первой (2) и второй (3) фракций, колонка 150х4.6 мм, Ультрасфер Si, 5 мкм, гексан – этанол (98:2), расход 4.5 мл/мин, 254 нм |
Изменение аналитической длины волны в УФД приводит к изменению соотношения площадей пиков таутомеров. В ПФ гексан – этанол (98:2) при 254 нм Sе/Sк =0.7; а при 310 нм Sе/Sк =2.8 (рис. 68).
|
Рис. 68. Соотношение площадей пиков таутомеров ОБА в зависимости от аналитической длины волны при количестве этанола в ПФ гексан - этанол 2 (а), 4 (б) и 10 (в) %. Колонка 150х4.6 мм, Ультрасфер Si, 5 мкм, расход 4.5 мл/мин |
Это связано с тем, что области поглощения енольной и кетонной форм различаются. В УФ-спектрах растворов ОБА (рис. 69) имеются интенсивные полосы поглощения при 245-254 и 290-316 нм, положение которых в разных растворителях изменяется мало, а интенсивность значительно. Согласно данным, приведенным в работе [27,48], при 310 нм поглощает свет преимущественно енольная форма β-дикарбонильных соединений, а в области 250 нм наибольший вклад в поглощение вносит кетоформа.
Эти выводы, полученные путем сопоставления спектров поглощения β-дикарбонильных соединений со степенью их енолизации, определенной химическими методами, были проверены на примере ОБА путем непосредственной регистрации УФ-спектров отдельных фракций, соответствующих хроматографическим пикам кето- и енольного таутомеров, в остановленном потоке ПФ фазы (рис. 70). Оказалось, что полосы поглощения как в области 250, так и 300 нм являются составными, однако для кетоформы наиболее интенсивный максимум лежит в области 250 нм, а для енола характерен максимум поглощения в области 280-320 нм, расщепленный на три пика.
|
Рис. 69. УФ-спектры свежеприготовленных растворов ЖК9 (1∙10-4 моль/л) в метаноле (1), гексане (2), ТГФ (3), в гексане через 75 мин (4), в гексане через сутки после приготовления раствора (5) |
|
Рис. 70. УФ-спектры в остановленном потоке кетоформы ОБА в точке а (1); енольной формы в точке б (2) (Новапак С18, ТГФ-вода, 70:30, расход 1 мл/мин) и УФ-спектр неразделенного пика ОБА (3) (μ-Бондапак СN, гексан - ИПС – диэтиламин, 99.4:0.5:0.1, расход 0.4 мл/мин |
|
Рис. 71. Корреляция содержания енольной формы ОБА от полярности растворителя (по данным ИК- и ПМР-спектрометрии) [49] |
Другим характерным для таутомеров признаком, который наблюдали на хроматограммах, является установление кето-енольного равновесия во времени. В НФХ на хроматограммах свежеприготовленного раствора ОБА интенсивность пика енола со временем растет, а кетоформы — падает.
При снятии УФ-спектров через разные промежутки времени после растворения ОБА также заметны изменения интенсивности - поглощение в области 250 нм уменьшается, а в области 300 нм увеличивается и один максимум расщепляется на три (рис. 70). По-видимому, в кристаллическом состоянии ОБА равновесие существенно смещено в сторону кетоформы.
Увеличение доли полярного растворителя в ПФ гексан – этанол с 2 до 10% приводит к уменьшению соотношения Se/SK в 2-3.4 раза в зависимости от выбранной длины волны в интервале 254-310 нм. Влияние состава ПФ на соотношение Se/SK вызвано тем, что кето-енольное равновесие β-кетоэфиров чувствительно к полярности растворителя. Увеличение полярности, таким образом, смещает равновесие в сторону образования кетоформы.
Действительно, прямое определение содержания таутомеров ОБА в различных растворителях с использованием спектров ПМР и ИК-спектроскопии по соотношению интегральных интенсивностей сигналов, соответствующих кето- и енольной формам, показало, что заметная доля ОБА существует в виде енола (от 6 до 46%), количество которого падает с увеличением полярности растворителя (табл. 61). Между параметром РN, характеризующим полярность растворителя, и степенью енолизации ОБА нами установлена тесная корреляция:
Се=45.8-24.3logPN, (102)
где се — доля енольной формы ОБА, % , R=0.9624, n=20.
Известно, что кето-енольное равновесие является хорошим индикатором полярности среды. Аналогичная корреляция найдена и для кето-енольного равновесия ацетоуксусного эфира Се=43.9-23.3logPN, R=0.9564, n=17. Положения равновесий в одинаковых средах для этой пары β-кетоэфиров оказались близки. Свободный член уравнения (102) соответствует, по-видимому, максимальной концентрации енола в гипотетической абсолютно неполярной среде. Уравнение (102) позволяет в первом приближении оценить равновесное содержание енольной формы ОБА в ПФ произвольного состава.
Таким образом, варьируя состав ПФ, можно на порядок изменить соотношение кетон/енол в анализируемой пробе. Наиболее благоприятные условия разделения таутомерных пиков наблюдали в слабополярных ПФ, которые содержали 90-100% гексана и 10-0% модификаторов – ИПС, этанола, диоксана и др. В этих условиях се, имеет максимальное значение 35—44% (табл. 62). При более высоких концентрациях модификаторов разделение пиков было либо неудовлетворительно, либо отсутствовало. В режиме ОФХ разделение пиков таутомеров, наоборот, замечено в наиболее полярной ПФ ТГФ – вода с содержанием воды 30—40%. В этом случае первым вымывается более полярный кетотаутомер. На качество разделения таутомеров влияют не только природа ПФ и НФ, но и скорость элюирования, температура. При увеличении скорости потока ПФ уменьшается ширина пиков и увеличивается глубина минимума между пиками енола и кетоформы. Наличие размытой зоны между этими пиками при низкой скорости элюирования можно связать с протеканием кето-енольных превращений в процессе хроматографирования. Повышение температуры колонки до 30 оС приводит к заметному ухудшению разделения пиков.
Разделение таутомеров нежелательно для количественного анализа реакционных масс, содержащих ОБА. Определение состава смесей, во-первых, дополнительно осложняется таутомерным раздвоением пиков, во-вторых, соотношение таутомерных пиков легко изменяется при незначительных колебаниях условий проведения анализа.
Таблица 61. Относительное содержание Ce (%) енольной формы ОБА в растворителях разной полярности (с=0.2 моль/л, 25 оС)[49]
Растворитель |
По данным ПМР |
По данным ИКС |
Гептан |
- |
45 |
Гексан-d14 |
43±4 |
48 |
СCl4 |
30±3 |
32 |
Толуол-d8 |
16±2 |
20 |
Бензол-d6 |
20±3 |
19 |
CDCl3 |
7±2 |
7 |
CD3OD-CHCl3 (1:3) |
8±2 |
- |
Ацетон-d6 |
12±3 |
- |
Пиридин-d5 |
10±3 |
11 |
CD3OD |
6±2 |
- |
CD3OD - ДМСО-d6 (1:4) |
7±2 |
- |
ДМСО- d6 |
6±2 |
- |
Таблица 62. Разделение таутомеров ОБА в разных условиях ВЭЖХ
НФ; зернение, мкм; размеры колонки, мм |
ПФ, (расход, мл/мин) |
Се, % |
RS |
λ, нм |
Силасорб CN; 7.0; 80×2 |
Гексан (0.2) |
44 |
9.74 |
260 |
Силасорб CN; 7,5; 250×4 |
Гексан - ИПС – триэтиламин, 99.49:0.5:0.05 (2) |
43 |
0 |
254 |
Сепарон CN; 7.0; 150х3.3 |
Гексан - ИПС, 99.8:0.2 (1.0) |
43 |
2.10 |
290 |
Ультрасфер Si; 5: 150×4.6 |
Гексан – этанол, 98:2 (4.5) |
41 |
2.60 |
254 |
Сепарон CN; 7.5; 150×3.3 |
Гексан - ИПС – хлороформ, 91.6:0.4:8.0 (1.0) |
36 |
1.33 |
290 |
Ультрасфер Si; 5; 150×х4.6 |
Гексан – этанол, 90:10 (4.5) |
35 |
0.86 |
254 |
Нуклеосил С18; 5; 64×2 |
Метанол (0.1) |
9 |
0 |
290 |
Новапак С185; 150×3.9 |
ТГФ – вода – ацетонитрил, 52:16:32 (1.0) |
6 |
0 |
290 |
Новапак С18; 5; 150×3.9 |
ТГФ - вода 70:30 (1.0) |
6 |
0.93 |
290 |
Наряду с изменением полярности ПФ для нивелирования таутомерного эффекта можно применять добавки к ПФ оснований диэтил- или триэтиламин, которые катализируют процесс таутомеризации. Благодаря резкому возрастанию скорости установления кето-енольного равновесия, хроматографического разделения таутомеров не происходит. Этот прием оказался удобен в тех случаях, когда изменение полярности ПФ ухудшает разделение ОБА с другими компонентами смеси. Например, для разделения смесей ОБА с его промежуточным продуктом – о-октадецилоксибензоилэтилацетатом оптимальные условия следующие: сорбенты Силасорб CN или μ-Бондапак CN в ПФ гексан – ИПС – триэтиламин (или диэтиламин) с содержанием ИПС 0—0.5% и основания 0.05—0.1%.