- •Введение
- •Оформление работы:
- •1. Дата.
- •2. Тема: номер и название работы.
- •Организация учебного процесса по биохимии
- •Правила техники безопасности при работе в биохимической лаборатории
- •Тема 1. Реакция среды
- •Работа 1. Определение реакции среды молока и яйца с помощью универсальной индикаторной бумаги
- •Работа 2. Определение реакции среды бесцветных растворов с помощью прибора Михаэлиса
- •Работа 3. Определение рН гомогената мышечной ткани, раствора яичного белка с помощью прибора Михаэлиса Приготовление гомогената из тканей животных
- •Ход опыта
- •Лучи света
- •Матовое стекло
- •Работа 4. Определение рН растворов и биологического материала электрометрическим (потенциометрическим) методом
- •Вопросы для самоподготовки по теме 1
- •Тема 2. Буферные системы
- •Работа 5. Приготовление ацетатного буферного раствора и изучение зависимости величины рН от соотношения компонентов
- •Работа 6. Изучение действия на буферный раствор небольшого количества кислоты
- •Работа 7. Изучение действия на буферный раствор большого количества кислоты
- •Работа 8. Изучение действия небольшого количества щелочи на буферный раствор
- •Работа 9. Изучение действия на буферный раствор большого количества щелочи
- •Работа 10. Влияние разбавления водой буферного раствора на величину его рН
- •Вопросы для самоподготовки по теме 2
- •Тема 3. Коллоидные растворы
- •Работа 11. Получение гидрофобного коллоидного раствора гидроксида железа Fe(oh)3.
- •Работа 13. Диализ коллоидных растворов
- •Работа 14. Изучение механизма коагуляции золя железа
- •Работа 15 . Изучение защитного действия гидрофильных коллоидов (эмульсоидов)
- •Вопросы для самоподготовки по теме 3
- •Tеma 4. Адсорбция и абсорбция
- •Работа 16. Адсорбция органических красок животным углем
- •Работа 17. Определение количества уксусной кислоты, адсорбированной животным углем
- •Вопросы для самоподготовки по теме 4
- •Тема 5. Химия и обмен белков
- •Работа 18. Определение количества белка в гомогенате мышечной ткани, яйце рефрактометрическим методом
- •Работа 19. Определение белка по методу Лоури
- •Работа 20. Разделение смеси аминокислот методом распределительной хроматографии на бумаге
- •Работа 21. Определение количества аминокислот в биоматериале по азоту аминогрупп методом формольного титрования по Серенсену
- •Работа 22. Изучение действия пепсина на переваривание белка
- •Вопросы для самоподготовки по теме 5
- •Тема 6. Ферменты (энзимы)
- •Работа 23. Приготовление раствора фермента -амилазы (кф 3.2.1. 1) слюны
- •Работа 24. Обнаружение в слюне амилазы и определение специфичности ее действия
- •Работа 25. Изучение влияния рН среды на активность амилазы слюны
- •Работа 26. Изучение влияния температуры на активность энзимов
- •Работа 27. Изучение действия активаторов и ингибиторов на активность ферментов
- •Вопросы для самоподготовки по теме 6
- •Тема 7. Углеводы и их обмен
- •Работа 28. Изучение механизма переваривания углеводов и определение активности -амилазы (кф 3.2.1.1.) слюны
- •Работа 29. Обнаружение гликогена в тканях животных
- •Вопросы для самоподготовки по теме 7
- •Тема 8. Липиды и их обмен
- •Работа 30. Изучение растворимости жира
- •Работа 31. Определение кислотного числа жира
- •Работа 32. Определение йодного числа.
- •Работа 33. Исследование эмульгирования жира
- •Работа 34. Изучение механизма переваривания липидов и определение активности панкреатической липазы (кф 3. 1. 1. 3)
- •Работа 35. Реакция обнаружения холестерола в растительном и животном маслах.
- •Вопросы для самоподготовки по теме 8
- •Тема 9. Витамины
- •Работа 36. Обнаружение витамина а в жире
- •Работа 37. Обнаружение витамина д в жире
- •Работа 38. Обнаружение витамина с в биоматериале
- •Вопросы для самоподготовки по теме 9
- •Тема 10. Минеральные вещества и вода
- •Работа 39. Определение количества кальция в молоке и гомогенате мышечной ткани по де Ваарду
- •Работа 40. Определение содержания кальция в молоке и гомогенате мышечной ткани комплексонометрическим методом
- •Работа 41. Определение количества неорганического фосфора в молоке и гомогенате мышечной ткани
- •Вопросы для самоподготовки по теме 10
- •Тема 11. Молоко
- •Работа 42. Определение общей кислотности молока по Тернеру
- •Работа 43 Выделение казеиногена из молока и исследование его свойств.
- •Работа 44. Определение редуктазы молока
- •Работа 45. Определение количества лактозы в молоке с помощью рефрактометра
- •Вопросы для самоподготовки по теме 11
- •Рекомендуемая литература.
Работа 19. Определение белка по методу Лоури
Метод основан на измерении интенсивности окраски белков, с помощью фотоэлектроколориметра или спектрофотометра. Метод очень чувствительный, так как позволяет определять от одного до нескольких мкг белка в пробе. При этом белки образуют окрашенные комплексы при одновременном протекании биуретовой реакции и реакции восстановления белками реактива Фолина (смесь фосфорно-вольфрамовой и фосфорно - молибденовой кислот образует с белками комплексное соединение синего цвета).
Для определения готовят следующие реактивы: А — 2% раствор углекислого натрия в 0,1 Н растворе NaOH; Б - 0,5% раствор сульфата меди в 1 % растворе лимоннокислого натрия; перед употреблением смешивают реактивы Б и А в соотношении 1:50 и получают реактив В;
Фолина - Чокальтеу - в 700 мл дистиллированной воды растворить 100 г вольфрамата натрия и 25 г молибдата натрия. Затем прилить 50 мл 85% раствора ортофосфорной кислоты и 100 мл концентрированной НСl. Смесь осторожно кипятить с обратным холодильником 10 - 12 ч. Потом добавить в нее 150 г сульфата лития, 50 мл воды и 5 - 6 капель брома. Снова прокипятить 10 - 15 мин без обратного холодильника для удаления избытка брома. После охлаждения довести объем раствора до 1 000 мл. Он должен быть прозрачным (в противном случае его отфильтровать через стеклянную вату), ярко-желтого цвета. Раствор Фолина оттитровать 0,1н раствором NaOH по фенолфталеину и на основании результатов титрования развести водой до 1 Н концентрации. Хранить в темной посуде.
Ход опыта
К 0,1 мл гомогената мышечной ткани прилить 9 мл реактива В, перемешать и оставить стоять на 10 мин при комнатной температуре. Потом к смеси прилить 0,9 мл реактива Фолина - Чокальтеу, перемешать. Через 30 мин провести фотоколориметрию (или спектрофотометрию) при длине волны 750 нм, сравнивая исследуемый раствор с контролем, в который вместо гомогената взять 0,1 мл дистиллированной воды, прилить все остальные реактивы. На ФЭКе или СФ найти оптическую плотность исследуемого раствора.
Расчет содержания белка произвести по калибровочному графику, который надо построить заранее, используя стандартный раствор бычьего альбумина. На оси абсцисс указывают содержание белка в пробе (мкг), на оси ординат - оптическую плотность (Д) исследуемого раствора.
Задание: 1. Выполнить опыт.
2. Определить содержание белка в гомогенате мышечной ткани и сравнить его с нормой для этого животного. В случае отклонения от нормы указать предполагаемые причины, последствия и пути их устранения.
Работа 20. Разделение смеси аминокислот методом распределительной хроматографии на бумаге
Метод основан на различии адсорбционных свойств и растворимости аминокислот в системе органический растворитель/вода при их продвижении по хроматографической бумаге.
Метод применяют для качественного и количественного определения аминокислот в белках тканей, органов, кормах и свободных аминокислот в биологических жидкостях.
Распределительная хроматография может быть нисходящая, восходящая и круговая.
При восходящей хроматографии полоска бумаги, с нанесенной на нее каплей раствора аминокислот, погружается в ванночку с растворителем, находящуюся на дне камеры (рис.5). Растворитель при этом движется снизу вверх, увлекая с собой аминокислоты. Они движутся по бумаге с различной скоростью, зависящей от их физико-химических свойств.
При достижении фронта растворителя линии финиша, бумажку вынимают из хроматографической камеры, просушивают и опрыскивают раствором нингидрина, с которым аминокислоты образуют комплексы, окрашенные в лиловый цвет.
Рис. 2. Восходящая хроматография ами- нокислот в пробирке: 1 – полоска хроматографической бумаги, 2 – место нанесения образца, 3 - растворитель |
Ход работы
Взять полоску хроматографической бумаги размером 110 см. Расположить ее на чистом листе обыкновенной бумаги и, отступя 1 см от нижнего края полоски, провести простым карандашом линию старта. Обозначить в ее середине диаметром 1 мм кружок, куда нанести микропипеткой 0,05-0,01 мл приготовленной смеси аминокислот. Пятно подсушить на воздухе. Затем полоску за противоположный край подвесить на крючок пробки хроматографической камеры, подтянуть за проволочку к пробке, с которой опустить в камеру до соприкосновения с растворителем (3), но чтобы линия старта была выше его. Если бумажка не достает до поверхности растворителя, то ее опустить, надавливая на проволоку в пробке, которой надо плотно закрыть камеру. Последнюю поставить в термостат при 35 - 40°С, находящийся под вытяжным шкафом. При достижении фронта растворителя линии финиша бумажку вынуть (камеру опять закрыть плотно пробкой) подвесить на крючок и подсушить при 105°С в сушильном шкафу. После этого хроматограмму взять за верхний край и смочить, протягивая в 0,1% спиртовом растворе нингидрина, налитом в чашку Петри или часовое стекло, и снова подвесить на крючке в сушильный шкаф. При реакции с нингидрином проявляющиеся пятна аминокислот приобретают лиловую окраску. Опытную хроматограмму сопоставить со стандартной, на которой нанесены известные аминокислоты. Одноименные аминокислоты на этих хроматограммах располагаются на равном расстоянии от линии старта и финиша.
Задание: 1. Выполнить опыт.
2. Зарисовать хроматографическую камеру (рис. 2).
3. Определить, какие аминокислоты находятся в исследуемом растворе. Написать их структурные формулы и указать биороль.
4. Объяснить принцип и технологию хроматографического метода разделения аминокислот.